尿酸酶、及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及经突变的尿酸酶，所述尿酸酶的结合位点和催化活性位点中的至少一个Y和/或至少一个M被突变，其中，所述Y被突变为H、F、S和G中的任意一种，所述M被突变为V、L和I中的任意一种。本发明专利技术的经突变的尿酸酶可抵抗因服用对乙酰氨基酚而带来的干扰。此外，本发明专利技术还涉及相关的制备方法、检测方法及用途。

【技术实现步骤摘要】
尿酸酶、及其制备方法和用途
本专利技术涉及尿酸检测领域，尤其涉及一种新的、经突变的尿酸酶。
技术介绍
生物体中，尿酸(UricAcid,UA)是嘌呤的代谢产物，它在血清中的溶解度极低。若缺乏有活性的尿酸酶，人体无法代谢尿酸形成其他溶解度更高的产物(如尿囊素、尿素等)。一般情况下，人体产生的尿酸和肾脏清除的尿酸可以维持平衡。但是，当人体产生的尿酸过多或者肾脏清除尿酸的能力降低，血清中会积累尿酸。目前，最常用的检测血清尿酸水平的方法是基于Trinder反应的尿酸酶-过氧化物酶法。这种方法的基本原理是利用其他生物(如真菌、细菌等)来源的尿酸酶将尿酸、水和氧气催化生成尿囊素、二氧化碳和过氧化氢。生成的过氧化氢可以与4-氨基安替比邻以及色原在过氧化物酶的催化作用下生成醌系色素和水。其中生成的醌系色素在特定波长的可见光有明显的吸收峰。可以通过检测吸光度确定生成的醌系色素的数量，进而可以推算出生成的过氧化氢以及样本中尿素的含量。对乙酰氨基酚(又称扑热息痛，Paracetamol)是一种常见的解热镇痛药。据报道，对于服用对乙酰氨基酚的个体，存在血清尿酸检测值偏低的问题。换句话说，对于服用对乙酰氨基酚的个体，使用基于尿酸酶-过氧化物酶法的尿酸检测项目评估其血清中尿酸含量，不能得到个体血清尿酸水平的真实数据，因而容易对后续医师的判断待来干扰。例如，对于表现出红肿、发炎等症状的个体来说，其可能服用对乙酰氨基酚以缓解红肿或者发炎导致的疼痛。而服用对乙酰氨基酚可能导致对个体尿酸水平的低估，导致影响医师后续判断。基于此，在尿酸检测领域，存在着消除因服用对乙酰氨基酚所带来的干扰的强烈需求。
技术实现思路
如前所述，在检测尿酸时，存在着因服用对乙酰氨基酚而导致的尿酸检测结果低于实际值的问题。这一问题可能是由于：对乙酰氨基酚在体内于肝脏中经过氧化作用生成中间产物NAPQI(N-acetyl-p-benzoquinone)，而NAPQI在利用尿酸酶-过氧化物酶法检测血清尿酸含量时带来了负干扰。然而，该负干扰的原理目前尚不明晰。也就是说，即使认为中间产物NAPQI是导致尿酸检测结果不准确(服用对乙酰氨基酚的情况下)的因素，目前也仍不清楚NAPQI是如何对尿酸检测的过程带来干扰，从而难以消除因服用对乙酰氨基酚所带来的尿酸检测结果不准确的缺陷。经研究，本专利技术人发现：对于该尿酸检测方法中的第二步反应，即过氧化氢与4-氨基安替比邻及色原在过氧化物酶的催化作用下生成醌系色素的反应，NAPQI没有明显的干扰。实际上，NAPQI干扰集中在该尿酸检测方法第一步反应中，即利用尿酸酶将尿酸、水和氧气催化生成尿囊素、二氧化碳和过氧化氢中。进一步地，经大量实验分析，NAPQI对尿酸检测干扰来源于其对第一步反应中尿酸酶酶活的影响。据此，在第一方面，本专利技术提供了一种经突变的尿酸酶，其特征在于，所述尿酸酶的结合位点和催化活性位点中的至少一个Y和/或至少一个M被突变，其中，所述Y被突变为H、F、S和G中的任意一种，所述M被突变为V、L和I中的任意一种。本专利技术的经突变的尿酸酶可代替常规的尿酸酶，用于基于Trinder反应的尿酸检测试剂中。在这样的情况下，能够成功抵抗样本中NAPQI所带来的干扰，从而提高尿酸水平的准确性。同时，该试剂扩宽了检测试剂的应用范围，免除受试者对乙酰氨基酚的服用禁忌。可以理解，根据尿酸酶的序列同源性分析(如图1)，尿酸酶催化活性位点上的酪氨酸(Y)，如MotifA上的首位Y，的常见天然同源残基为H；而苯丙氨酸(F)与酪氨酸(Y)在结构上相近。另一方面，甘氨酸(G)与丝氨酸(S)同为结构简单且能减少蛋白质空间位阻的氨基酸残基。另一方面，尿酸酶催化活性位点上的甲硫氨酸(M)，如MotifB上的M，的常见天然同源残基为I或V，L也是与其性质接近的氨基酸残基。在一些的实施方式中，所述Y位于所述尿酸酶的MotifA中。在具体的实施方式中，所述Y位于所述尿酸酶的MotifA的首位。在一些实施方式中，所述Y被突变为H。在另一些实施方式中，所述Y被突变为G。在一些的实施方式中，所述M位于所述尿酸酶的MotifB中。在具体的实施方式中，所述M位于所述尿酸酶的MotifB的第10位。在一些实施方式中，所述M被突变为L。在另一些实施方式中，所述M被突变为I。在一些实施方式中，对Y的突变发生在尿酸酶的催化活性位点上。在一些实施方式中，对M的突变发生在尿酸酶的催化活性位点上。另外，本专利技术的经突变的尿酸酶可进一步包括位于非结合位点且位于非催化活性位点处的至少一个额外突变。在一些实施方式中，所述额外突变是将选自C、M、Y和W的氨基酸残基突变为除C、M、Y和W外的其它氨基酸残基。在又一些实施方式中，所述额外突变是使选自C、M、Y和W的氨基酸残基缺失。在优选的实施方式中，所述额外突变发生在所述结合位点和/或催化活性位点的附近。在一些实施方式中，所述额外突变发生在所述结合位点和/或催化活性位点中每一个的上游5个残基和/或下游5个残基以内。通过在非结合和非催化活性位点处，尤其是它们附近(如上游5个残基和/或下游5个残基以内)，引入额外的突变，本专利技术进一步改善了消除NAPQI负干扰的能力。在一些实施方式中，本专利技术的尿酸酶源自Aspergillusflavus、Bacillussp.TB-90或Candidautilis。在示例性的实施方式中，本专利技术的经突变的尿酸酶源自Aspergillusflavus，并且具有Y9H突变；优选地，进一步包括选自Y17F、Y47F、Y66H、M232L和Y233F所组成的组的至少一个额外突变。在示例性的实施方式中，本专利技术的经突变的尿酸酶源自Bacillussp.TB-90，并且具有Y11H和M76I突变；优选地，进一步包括选自M9Q、Y10R和Y254F所组成的组的至少一个额外突变。在示例性的实施方式中，本专利技术的经突变的尿酸酶源自Candidautilis，并且具有Y10H突变；优选地，进一步包括选自Y49F、Y112V和M238L所组成的组的至少一个额外突变。在第二方面，本专利技术提供了一种核酸，所述核酸编码本专利技术的经突变的尿酸酶。在第三方面，本专利技术提供了一种检测尿酸的试剂盒，其包括本专利技术的经突变的尿酸酶。在具体的实施方式中，本专利技术的试剂盒进一步包括色原、过氧化物酶和4-AAP。在具体的实施方式中，本专利技术的试剂盒可以为如下的形式：第一试剂，含色原；和第二试剂，含4-AAP和本专利技术的经突变的尿酸酶，其中，所述试剂盒还包括存在于第一试剂和/或第二试剂中的过氧化物酶。在一个变型中，本专利技术的试剂盒可以为如下的形式：第一试剂，含4-AAP；和第二试剂，含色原和本专利技术的经突变的尿酸酶，其中，所述试剂盒还包括存在于第一试剂和/或第二试剂中的过氧化物酶。在第四方面，本专利技术提供了一种制本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种经突变的尿酸酶，其特征在于，所述尿酸酶的结合位点和催化活性位点中的至少一个Y和/或至少一个M被突变，其中，所述Y被突变为H、F、S和G中的任意一种，所述M被突变为V、L和I中的任意一种。/n

【技术特征摘要】
1.一种经突变的尿酸酶，其特征在于，所述尿酸酶的结合位点和催化活性位点中的至少一个Y和/或至少一个M被突变，其中，所述Y被突变为H、F、S和G中的任意一种，所述M被突变为V、L和I中的任意一种。


2.权利要求1所述的经突变的尿酸酶，其中，所述Y位于所述尿酸酶的MotifA中，如MotifA的第1位，所述M位于所述尿酸酶的MotifB中，如MotifB的第10位。


3.权利要求1或2所述的经突变的尿酸酶，其中，所述Y被突变为H或G。


4.权利要求1或2所述的经突变的尿酸酶，其中，所述经突变的尿酸酶进一步包括位于非结合位点且位于非催化活性位点处的至少一个额外突变。


5.权利要求4所述的经突变的尿酸酶，其中，所述额外突变是将选自C、M、Y和W的氨基酸残基突变为除C、M、Y和W外的氨基酸残基，和/或使选自C、M、Y和W的氨基酸残基缺失。


6.权利要求4或5所述的经突变的尿酸酶，其中，所述额外突变发生在所述结合位点和/或催化活性位点附近，例如所述结合位点和/或催化活性位点中每一个的上游5个残基和/或下游5个残基以内。


7.权利要求1、2和5任一项中所述的经突变的尿酸酶，其中，所述尿酸酶源自Aspergillusflavus、Bacillussp.TB-90或Candidautilis。


8.权利要求7所述的经突变的尿酸酶，其中，所述尿酸酶源自Aspergillusflavus并存在Y9H突变；可选的，额外突变选自Y17F、Y47F、Y66H、M232L和Y233F所组成的组。


9.权利要求7所述的经突变的尿酸酶，其中，所述尿酸酶源自Bacillussp.TB-90并存在Y11H和M76I突变；可选的，额外突变选自M9Q、Y10R和Y254F所组成的组。


10.权利要求7所述的经突变的尿酸酶，其中，所述尿酸酶源自Candidautilis并存在Y10H突变；可选的，额外突变选自Y49F、Y112V和M238L所组成的组。


11.一种核酸，其编码权利要求1～10中任一项所述的经突...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭庆功，林春娇，张裕平，
申请(专利权)人：深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44