一种质控菌株定量小球的制备及使用方法技术

本发明专利技术涉及微生物冻干球制备及使用技术领域，具体是一种质控菌株定量小球的制备及使用方法。制备方法包括如下步骤：(1)质控菌株的单菌落挑至液体培养基中，培养至对数生长期，得菌液；(2)取定量菌液至冻干菌种保护剂中，并用保护剂稀释得保护剂菌液；(3)取定量保护剂菌液，用液氮冷冻成球后进行预冻；(4)将步骤(3)得到预冻小球进行真空冷冻干燥，得干燥小球；(5)分装。使用方法：将1ml无菌生理盐水加入装有冻干菌球的西林瓶，充分溶解混匀，即可得到含一定菌数的菌液，直接用于后续实验。本发明专利技术制备得到的定量小球具有能够满足质控样品使用要求，制备方法简单，使用方便的有益效果。

【技术实现步骤摘要】
一种质控菌株定量小球的制备及使用方法
本专利技术涉及微生物冻干球制备及使用
，具体是一种质控菌株定量小球的制备及使用方法。
技术介绍
实验室数据可靠性和有效性是检验工作和科学研究的生命线。利用微生物标准菌株进行检验方法学验证试验越来越受到重视，继《中国药典》要求进行微生物检验方法适用性试验后，保健食品和化妆品风险监测工作中也提出相关要求。利用标准菌种作为参考标准物质，进行药品、保健食品和化妆品微生物检验过程控制，是保障检验结果科学准确的重要环节，《中国药典》、保健食品和化妆品风险监测工作手册等均有明确要求。微生物检验方法学适用性试验需要用到含有一定菌数的标准菌株，传统的梯度稀释方法操作繁琐，工作量较大。微生物定量质控菌株是考查实验室检验结果准确、可靠的重要工具，适用于食品、药品微生物检测的定量质控菌株是制约微生物检验标准化的一个瓶颈。
技术实现思路
本专利技术提供一种质控菌株定量小球的制备及使用方法，解决了现有技术中菌液梯度稀释方法操作繁琐，工作量较大的技术问题。本专利技术是这样实现的：包括如下步骤：(1)质控菌株的单菌落挑至液体培养基，培养至对数生长期，得菌液；(2)取定量菌液至冻干菌种保护剂中，并用保护剂稀释得保护剂菌液；(3)取定量保护剂菌液，用液氮定型成球后进行预冻；(4)将步骤(3)得到预冻小球进行真空冷冻干燥，得干燥小球；(5)分装。作为一种优选的实施方案，步骤(2)中，所述冻干菌种保护剂包括以下组分及其质量配比：蛋白质10％，水溶性糖5％，冻干塑形剂10％，余量为水。作为一种优选的实施方案，所述冻干菌种保护剂为蛋白质、水溶性糖与冻干塑形剂全部溶解后，经115℃高压灭菌20分钟，冷却所得。作为一种优选的实施方案，所述蛋白质为人血清白蛋白、小牛血清、脱脂奶粉中的至少一种；所述水溶性糖为蔗糖、葡萄糖、海藻糖、乳糖、半乳糖中的至少一种；所述冻干塑形剂为聚乙二醇4000、聚乙二醇8000及聚乙二醇20000、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。作为一种优选的实施方案，步骤(3)中，液氮冷冻过程中使用液氮冷冻小球装置，所述液氮冷冻小球装置包括保温容器，点样针和冷冻多孔板，所述保温容器内容纳液氮，所述冷冻多孔板置于所述保温容器内部，所述冷冻多孔板设有数个间隔板，所述间隔板纵横交叉形成数个冷冻空间，每个冷冻空间底部设冷冻孔，所述点样针置于所述保温容器上方，所述点样针底端距离液氮液面5-8cm，向所述冷冻孔滴菌液，待所有所述冷冻间隔空间均滴入一滴菌液，菌液冷冻成小球之后，再重复向所述冷冻空间滴加菌液的操作。作为一种优选的实施方案，所述步骤(2)中，吸取菌液50ul。作为一种优选的实施方案，所述步骤(2)中，菌液稀释100倍。作为一种优选的实施方案，所述步骤(3)中，预冻条件为-35℃，2h。作为一种优选的实施方案，所述步骤(4)中，真空冷冻干燥参数：-35℃～-30℃，干燥6-7h；10℃-25℃二次干燥2-3h。一种质控菌株定量小球的使用方法，将1ml无菌生理盐水加入装有冻干菌球的西林瓶，充分溶解混匀，即可得到含有一定菌数的菌液，直接用于后续实验。本专利技术的有益效果：蛋白质溶于水中形成胶体溶液，分子直径为1-2nm，包裹在菌体外侧形成蛋白膜，对细胞加以保护，固定冻干酶类，防止由于细胞壁蛋白质损坏而引起的胞内物质泄漏，可以减少冷冻干燥引起的微生物细胞损伤。水溶性糖，尤其是海藻糖具有特殊的水合作用，能够稳定细胞膜和蛋白质结构，抗逆保鲜，保护菌体，减少在冷冻干燥过程中的损伤。选用的冷冻塑型剂，无毒、无刺激，有良好的吸湿性、润滑性、粘结性，有助于冷冻小球的成形和干燥后形状的稳定。控制点样针针头的粗细以及针头距离液氮的高度为5-8cm，稳定滴入菌液，有效避免液体崩裂。冷冻多孔板的冷冻空间底部设有冷冻孔，该冷冻孔为穿孔或冷冻空间底部为镂空状，点样针向每个冷冻空间逐一滴入菌滴，隔离未完全固化的小球，避免液氮冷冻过程中，小球粘连成堆的现象。本专利技术提供的制备方法工艺简单，成本低，所得的质控菌株定量小球，外观完整，数量可控，均一稳定性佳，复溶性好，无需复活即可直接使用，可以实现直接获得含有指定菌数的质控菌株小球，使用更加方便，有广泛的应用前景。具体实施方式一种质控菌株定量小球的制备方法，包括如下步骤：(1)质控菌株的单菌落挑至液体培养基中，培养至对数生长期，得菌液；(2)取定量菌液至冻干菌种保护剂中稀释得保护剂菌液；(3)取定量保护剂菌液，用液氮定型成球后进行预冻；(4)将步骤(3)得到预冻小球进行真空冷冻干燥，得干燥小球；(5)分装至无菌西林瓶，每个无菌西林瓶内装有一个干燥小球。步骤(2)中，每100ml所述冻干菌种保护剂包括以下组分及其质量配比：蛋白质10％，水溶性糖5％，冻干塑形剂10％，余量为水。质控菌株的单菌落培养的对数生长期根据不同菌种，进行相应调整，不同菌种的对数生长期不同。以大肠埃希氏菌ATCC25922为例，在36°环境下培养18-24h得到菌液。进一步地，所述冻干菌种保护剂为所有组分全部充分溶解后，经115℃高压灭菌20分钟，取出，冷却得到。进一步地，所述蛋白质为人血清白蛋白、小牛血清、脱脂奶粉中的至少一种；所述水溶性糖为蔗糖、葡萄糖、海藻糖、乳糖、半乳糖中的至少一种；所述冻干塑形剂为聚乙二醇4000、聚乙二醇8000及聚乙二醇20000、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。步骤(3)中，液氮冷冻过程中使用液氮冷冻小球装置，所述液氮冷冻小球装置包括保温容器，点样针和冷冻多孔板，所述保温容器内容纳液氮，所述冷冻多孔板安装于所述保温容器内部，冷冻多孔板的上沿低于保温器的上沿，所述冷冻多孔板与所述保温容器的位置保持相对固定。若冷冻多孔板上沿高于保温容器的上沿，容易出现液滴沾到分隔壁上的现象。可先放冷冻多孔板，再倒入液氮，避免出现液氮倒的太多，冷冻多孔板漂起的问题。所述冷冻多孔板设有数个竖直向上延伸的间隔板，所述间隔板纵横交叉形成数个冷冻空间，每个冷冻空间底部均设冷冻孔，所述冷冻孔为穿孔或冷冻空间底部镂空，形成一个冷冻通道，冷冻孔的作用是为了让液氮进入冷冻空间，令菌液冷冻成球。其中冷冻空间底部为镂空状态时，冷冻孔的上、下表面积与单个冷冻空间的上、下表面积相等，此时，冷冻多孔板较冷冻孔为穿孔时不易漂起。点样针可选用5ml注射器适配的针头。所述点样针抽取保护剂菌液后，在所述保温容器上方，所述点样针底端距离液氮液面5-8cm，保证液滴流畅滴下，向每个所述冷冻空间内逐一滴菌液，待一波菌液在液氮环境中冷冻成小球之后，再滴加下一波菌液，重复前述动作，最后形成的冷冻小球经过多孔板的通孔，沉入所述保温容器的底部。菌液的流速和流量可以通过微量蠕动泵或人工控制。保温容器可以选用保温杯，双层保温容器，或者其他具有保温性能的容器。进一步地，所述步骤(2)中，吸取菌液50ul。进一步地，所述步骤(2)中，菌液稀释本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种质控菌株定量小球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)质控菌株的单菌落挑至液体培养基中，培养至对数生长期，得菌液；/n(2)取定量菌液至冻干菌种保护剂中，并用保护剂稀释得保护剂菌液；/n(3)取定量保护剂菌液，用液氮冷冻成球后进行预冻；/n(4)将步骤(3)得到预冻小球进行真空冷冻干燥，得干燥小球；/n(5)分装至西林瓶。/n

【技术特征摘要】
1.一种质控菌株定量小球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)质控菌株的单菌落挑至液体培养基中，培养至对数生长期，得菌液；
(2)取定量菌液至冻干菌种保护剂中，并用保护剂稀释得保护剂菌液；
(3)取定量保护剂菌液，用液氮冷冻成球后进行预冻；
(4)将步骤(3)得到预冻小球进行真空冷冻干燥，得干燥小球；
(5)分装至西林瓶。


2.根据权利要求1所述的一种质控菌株定量小球的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，每100ml所述冻干菌种保护剂包括以下组分及其质量配比：蛋白质10％，水溶性糖5％，冻干塑形剂10％，余量为水。


3.根据权利要求2所述的一种质控菌株定量小球的制备方法，其特征在于，所述冻干菌种保护剂为蛋白质、水溶性糖与冻干塑形剂全部溶解后，经115℃高压灭菌20分钟，冷却所得。


4.根据权利要求3所述一种质控菌株定量小球的制备方法，其特征在于，所述蛋白质为人血清白蛋白、小牛血清、脱脂奶粉中的至少一种；所述水溶性糖为蔗糖、葡萄糖、海藻糖、乳糖、半乳糖中的至少一种；所述冻干塑形剂为聚乙二醇4000、聚乙二醇8000及聚乙二醇20000、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。


5.根据权利要求1所述的一种质控菌株定量小球的制备方法，其特征在于，步...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡向荣，许英俊，李杜娟，
申请(专利权)人：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37