使用随机引发的单细胞全转录组分析制造技术

本文的公开内容包括用于使用随机引发和延伸(random priming and extension，RPE)进行全转录组分析(whole transcriptome analysis，WTA)的系统、方法、组合物和试剂盒。基于RPE的WTA方法可以包括使随机引物与多于一种与固体支持物关联的第一链条形码化多核苷酸杂交，并使随机引物延伸以产生多于一种延伸产物。该方法可以包括扩增多于一种延伸产物以产生测序文库。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用随机引发的单细胞全转录组分析相关申请本申请根据35U.S.C.§119(e)，要求2018年11月8日提交的美国临时专利申请序列第62/757,757号的权益，该相关申请的内容出于所有目的通过引用以其整体并入本文。对序列表的引用本申请连同电子格式的序列表一起提交。序列表被提供为题为68EB_298705_WO的文件，创建于2019年11月7日，大小是4千字节。电子格式的序列表的信息通过引用以其整体并入本文。背景领域本公开内容总体上涉及分子生物学领域，例如使用分子条形码化(molecularbarcoding)确定细胞的基因表达谱。对现有技术的描述当前的技术允许在每个细胞与隔室(compartment)中的条形码化试剂珠共定位时通过将细胞特异性寡核苷酸条形码附接到来自个体细胞的多(A)mRNA分子而以大规模平行的方式(例如，>10000个细胞)测量单细胞的基因表达。对能够有效地定量分析细胞的基因表达的系统和方法存在需求。概述本文的公开内容包括对样品中的核酸靶进行标记的方法。在一些实施方案中，方法包括：使核酸靶的拷贝与多于一种寡核苷酸条形码接触，其中每种寡核苷酸条形码包含第一通用序列、分子标记和能够与核酸靶的拷贝杂交的靶结合区；使与核酸靶的拷贝杂交的多于一种寡核苷酸条形码延伸以产生多于一种第一链条形码化多核苷酸；使随机引物与多于一种第一链条形码化多核苷酸接触，其中每种随机引物包含第二通用序列或其互补体；以及使与多于一种第一链条形码化多核苷酸杂交的随机引物延伸以产生多于一种延伸产物。在一些实施方案中，方法包括：使用能够与第一通用序列或其互补体杂交的引物和能够与第二通用序列或其互补体杂交的引物扩增多于一种延伸产物，从而产生第一多于一种条形码化扩增子。在一些实施方案中，扩增多于一种延伸产物包括将测序引物和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的结合位点的序列添加到多于一种延伸产物。在一些实施方案中，方法包括：基于与第一多于一种条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数量，确定样品中核酸靶的拷贝数。本文的公开内容包括确定样品中核酸靶的数量的方法。在一些实施方案中，方法包括：使核酸靶的拷贝与多于一种寡核苷酸条形码接触，其中每种寡核苷酸条形码包含第一通用序列、分子标记和能够与核酸靶的拷贝杂交的靶结合区；使与核酸靶的拷贝杂交的多于一种寡核苷酸条形码延伸以产生多于一种第一链条形码化多核苷酸；使随机引物与多于一种第一链条形码化多核苷酸接触，其中每种随机引物包含第二通用序列或其互补体；使与多于一种第一链条形码化多核苷酸杂交的随机引物延伸以产生多于一种延伸产物；使用能够与第一通用序列或其互补体杂交的引物和能够与第二通用序列或其互补体杂交的引物扩增多于一种延伸产物，从而产生第一多于一种条形码化扩增子；以及基于与第一多于一种条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数量，确定样品中核酸靶的拷贝数。在一些实施方案中，使核酸靶的拷贝接触包括使多于一种核酸靶的拷贝与多于一种寡核苷酸条形码接触，使多于一种寡核苷酸条形码延伸包括使与多于一种核酸靶的拷贝杂交的多于一种寡核苷酸条形码延伸以产生多于一种第一链条形码化多核苷酸，并且确定样品中核酸靶的拷贝数包括基于与第一多于一种条形码化扩增子中的条形码化扩增子关联的具有不同序列的分子标记的数量来确定样品中多于一种核酸靶中的每一种的数量，所述第一多于一种条形码化扩增子包括多于一种核酸靶中的每一种的序列。在一些实施方案中，多于一种核酸靶中的每一种的序列包括多于一种核酸靶中的每一种的子序列。在一些实施方案中，第一多于一种条形码化扩增子中的核酸靶的序列包括核酸靶的子序列。在一些实施方案中，方法包括使用能够与第一通用序列或其互补体杂交的引物和能够与第二通用序列或其互补体杂交的引物扩增第一多于一种条形码化扩增子，从而产生第二多于一种条形码化扩增子。在一些实施方案中，扩增第一多于一种条形码化扩增子包括将测序引物和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的结合位点的序列添加到第一多于一种条形码化扩增子。在一些实施方案中，方法包括基于与第二多于一种条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数量，确定样品中核酸靶的拷贝数。在一些实施方案中，使核酸靶的拷贝接触包括使多于一种核酸靶的拷贝与多于一种寡核苷酸条形码接触，使多于一种寡核苷酸条形码延伸包括使与多于一种核酸靶的拷贝杂交的多于一种寡核苷酸条形码延伸以产生多于一种第一链条形码化多核苷酸，和/或其中确定样品中核酸靶的拷贝数包括基于与第二多于一种条形码化扩增子中的条形码化扩增子关联的具有不同序列的分子标记的数量来确定样品中多于一种核酸靶中的每一种的数量，所述第二多于一种条形码化扩增子包括多于一种核酸靶中的每一种的序列。在一些实施方案中，多于一种核酸靶中的每一种的序列包括多于一种核酸靶中的每一种的子序列。在一些实施方案中，第二多于一种条形码化扩增子中的核酸靶的序列包括核酸靶的子序列。在一些实施方案中，第一多于一种条形码化扩增子和/或第二多于一种条形码化扩增子中的每一种包含以下的至少一部分：第一通用序列、第二通用序列或二者。在一些实施方案中，第一通用序列和第二通用序列是相同的。在一些实施方案中，第一通用序列和第二通用序列是不同的。在一些实施方案中，第一通用序列和/或第二通用序列包含测序引物和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的结合位点。在一些实施方案中，测序衔接子包括P5序列、P7序列、其互补序列和/或其部分。在一些实施方案中，测序引物包括读段1测序引物、读段2测序引物、其互补序列和/或其部分。在一些实施方案中，使与核酸靶的拷贝杂交的多于一种寡核苷酸条形码延伸包括使用逆转录酶使与核酸靶的拷贝杂交的多于一种寡核苷酸条形码延伸。在一些实施方案中，逆转录酶包括病毒逆转录酶。在一些实施方案中，使与核酸靶的拷贝杂交的多于一种寡核苷酸条形码延伸包括使用缺乏5'至3'核酸外切酶活性和3'至5'核酸外切酶活性中的至少一种的DNA聚合酶使与核酸靶的拷贝杂交的多于一种寡核苷酸条形码延伸。在一些实施方案中，使与多于一种第一链条形码化多核苷酸杂交的随机引物延伸包括使用缺乏5'至3'核酸外切酶活性和3'至5'核酸外切酶活性中的至少一种的DNA聚合酶使与多于一种第一链条形码化多核苷酸杂交的随机引物延伸。在一些实施方案中，DNA聚合酶包含Klenow片段。在一些实施方案中，第一多于一种条形码化扩增子和/或第二多于一种条形码化扩增子包含全转录组扩增(WTA)产物。在一些实施方案中，第一多于一种条形码化扩增子和/或第二多于一种条形码化扩增子对应于单细胞的mRNA的至少10％。在一些实施方案中，第一多于一种条形码化扩增子和/或第二多于一种条形码化扩增子对应于单细胞的mRNA的至少50％或至少90％。在一些实施方案中，多于一种核酸靶中的一种或更多种包括低表达基因的mRNA。在一些实施方案中，所述随机引物包含随机核苷酸序列，任选地，随机核苷酸序列的长度为约4个至约30个核苷酸，并且还任选地，所述随机核本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对样品中的核酸靶进行标记的方法，所述方法包括：/n使核酸靶的拷贝与多于一种寡核苷酸条形码接触，其中每种寡核苷酸条形码包含第一通用序列、分子标记和能够与所述核酸靶的拷贝杂交的靶结合区；/n使与所述核酸靶的拷贝杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码延伸以产生多于一种第一链条形码化多核苷酸；/n使随机引物与所述多于一种第一链条形码化多核苷酸接触，其中每种所述随机引物包含第二通用序列或其互补体；以及/n使与所述多于一种第一链条形码化多核苷酸杂交的所述随机引物延伸以产生多于一种延伸产物。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181108 US 62/757,7571.一种对样品中的核酸靶进行标记的方法，所述方法包括：
使核酸靶的拷贝与多于一种寡核苷酸条形码接触，其中每种寡核苷酸条形码包含第一通用序列、分子标记和能够与所述核酸靶的拷贝杂交的靶结合区；
使与所述核酸靶的拷贝杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码延伸以产生多于一种第一链条形码化多核苷酸；
使随机引物与所述多于一种第一链条形码化多核苷酸接触，其中每种所述随机引物包含第二通用序列或其互补体；以及
使与所述多于一种第一链条形码化多核苷酸杂交的所述随机引物延伸以产生多于一种延伸产物。


2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括使用能够与所述第一通用序列或其互补体杂交的引物和能够与所述第二通用序列或其互补体杂交的引物扩增所述多于一种延伸产物，从而产生第一多于一种条形码化扩增子。


3.根据权利要求2所述的方法，其中扩增所述多于一种延伸产物包括将测序引物和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的结合位点的序列添加到所述多于一种延伸产物。


4.根据权利要求2-3中任一项所述的方法，所述方法包括基于与所述第一多于一种条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数量，确定所述样品中所述核酸靶的拷贝数。


5.一种用于确定样品中核酸靶的数量的方法，所述方法包括：
使核酸靶的拷贝与多于一种寡核苷酸条形码接触，其中每种寡核苷酸条形码包含第一通用序列、分子标记和能够与所述核酸靶的拷贝杂交的靶结合区；
使与所述核酸靶的拷贝杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码延伸以产生多于一种第一链条形码化多核苷酸；
使随机引物与所述多于一种第一链条形码化多核苷酸接触，其中每种所述随机引物包含第二通用序列或其互补体；
使与所述多于一种第一链条形码化多核苷酸杂交的所述随机引物延伸以产生多于一种延伸产物；
使用能够与所述第一通用序列或其互补体杂交的引物和能够与所述第二通用序列或其互补体杂交的引物扩增所述多于一种延伸产物，从而产生第一多于一种条形码化扩增子；以及
基于与所述第一多于一种条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数量，确定所述样品中所述核酸靶的拷贝数。


6.根据权利要求4-5中任一项所述的方法，
其中使核酸靶的拷贝接触包括使多于一种核酸靶的拷贝与多于一种寡核苷酸条形码接触，
其中使所述多于一种寡核苷酸条形码延伸包括使与所述多于一种核酸靶的拷贝杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码延伸以产生多于一种第一链条形码化多核苷酸，以及
其中确定所述样品中所述核酸靶的拷贝数包括基于与所述第一多于一种条形码化扩增子中的条形码化扩增子关联的具有不同序列的所述分子标记的数量来确定所述样品中所述多于一种核酸靶中的每一种的数量，所述第一多于一种条形码化扩增子包括所述多于一种核酸靶中的每一种的序列。


7.根据权利要求6所述的方法，其中所述多于一种核酸靶中的每一种的序列包括所述多于一种核酸靶中的每一种的子序列。


8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其中所述第一多于一种条形码化扩增子中的所述核酸靶的序列包括所述核酸靶的子序列。


9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，所述方法包括使用能够与所述第一通用序列或其互补体杂交的引物和能够与所述第二通用序列或其互补体杂交的引物扩增所述第一多于一种条形码化扩增子，从而产生第二多于一种条形码化扩增子。


10.根据权利要求9所述的方法，其中扩增所述第一多于一种条形码化扩增子包括将测序引物和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的结合位点的序列添加到所述第一多于一种条形码化扩增子。


11.根据权利要求9-10中任一项所述的方法，所述方法包括基于与所述第二多于一种条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数量，确定所述样品中所述核酸靶的拷贝数。


12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，
其中使核酸靶的拷贝接触包括使多于一种核酸靶的拷贝与多于一种寡核苷酸条形码接触，
其中使所述多于一种寡核苷酸条形码延伸包括使与所述多于一种核酸靶的拷贝杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码延伸以产生多于一种第一链条形码化多核苷酸，和/或
其中确定所述样品中所述核酸靶的拷贝数包括基于与所述第二多于一种条形码化扩增子中的条形码化扩增子关联的具有不同序列的所述分子标记的数量来确定所述样品中所述多于一种核酸靶中的每一种的数量，所述第二多于一种条形码化扩增子包括所述多于一种核酸靶中的每一种的序列。


13.根据权利要求12所述的方法，其中所述多于一种核酸靶中的每一种的序列包括所述多于一种核酸靶中的每一种的子序列。


14.根据权利要求9-13中任一项所述的方法，其中所述第二多于一种条形码化扩增子中的所述核酸靶的序列包括所述核酸靶的子序列。


15.根据权利要求2-14中任一项的方法，其中所述第一多于一种条形码化扩增子和/或第二多于一种条形码化扩增子中的每一种包含以下的至少一部分：所述第一通用序列、所述第二通用序列或二者。


16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述第一通用序列和所述第二通用序列是相同的。


17.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述第一通用序列和所述第二通用序列是不同的。


18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述第一通用序列和/或所述第二通用序列包含测序引物和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的结合位点。


19.根据权利要求18所述的方法，其中所述测序衔接子包括P5序列、P7序列、其互补序列和/或其部分。


20.根据权利要求18所述的方法，其中所述测序引物包括读段1测序引物、读段2测序引物、其互补序列和/或其部分。


21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中使与所述核酸靶的拷贝杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码延伸包括使用逆转录酶使与所述核酸靶的拷贝杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码延伸。


22.根据权利要求21所述的方法，其中所述逆转录酶包括病毒逆转录酶。


23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中使与所述核酸靶的拷贝杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码延伸包括使用缺乏5'至3'核酸外切酶活性和3'至5'核酸外切酶活性中的至少一种的DNA聚合酶使与所述核酸靶的拷贝杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码延伸。


24.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中使与所述多于一种第一链条形码化多核苷酸杂交的所述随机引物延伸包括使用缺乏5'至3'核酸外切酶活性和3'至5'核酸外切酶活性中的至少一种的DNA聚合酶使与所述多于一种第一链条形码化多核苷酸杂交的所述随机引物延伸。


25.根据权利要求22-24中任一项所述的方法，其中所述DNA聚合酶包括Klenow片段。


26.根据权利要求2-25中任一项所述的方法，其中所述第一多于一种条形码化扩增子和/或所述第二多于一种条形码化扩增子包含全转录组扩增(WTA)产物。


27.根据权利要求2-26中任一项所述的方法，其中所述第一多于一种条形码化扩增子和/或所述第二多于一种条形码化扩增子对应于单细胞的mRNA的至少10％。


28.根据权利要求2-26中任一项所述的方法，其中所述第一多于一种条形码化扩增子和/或所述第二多于一种条形码化扩增子对应于单细胞的mRN...

【专利技术属性】
技术研发人员：艾琳·夏姆，
申请(专利权)人：贝克顿迪金森公司，
类型：发明
国别省市：美国;US