一种氟标签及其制备方法、辅助的酶法合成寡糖链的方法技术

本发明专利技术涉及一种氟标签及其制备方法、辅助的酶法合成寡糖链的方法。氟标签，结构式如式Ⅰ所示，G‑R(Ⅰ)。其中，G代表单糖或低聚糖；R为下列式Ⅱ、式Ⅲ中的一种：

【技术实现步骤摘要】
一种氟标签及其制备方法、辅助的酶法合成寡糖链的方法
本专利技术属于糖类物质的分离方法
，具体涉及一种氟标签及其制备方法、辅助的酶法合成寡糖链的方法。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。碳水化合物是三大天然生物大分子之一，在生命过程中起着重要作用，且与许多疾病的发展密切相关。由于从天然来源中分离得到高纯度且结构单一的寡糖是非常费力费时的，因此快速高效的合成结构确定的寡糖是至关重要。为了提高寡糖合成的效率，已经发展了多种简化寡糖纯化过程的策略。其中，通过氟标签协助的氟液-液萃取(FLLE)或氟固相萃取(FSPE)技术在最近二十年中已被广泛关注。但是，由于重氟标签在普通有机溶剂中的溶解性差(F含量大于60％)以及在FLLE过程中使用氟化溶剂的成本较高，因此FLLE在碳水化合物合成中的应用范围受到限制。作为FLLE的替代品，FSPE近年来以酯甲硅烷基醚，苄基醚的轻质氟标签(F含量小于40％)的使用迅速发展。最近，一些轻氟标签已用于寡糖的自动液相合成中。然而，这些轻氟标签具有一些缺点，例如对酸或碱不稳定，较低的负载能力，并且难以切除和再生。氟固相萃取(FSPE)是一种具有应用前景的低聚糖自动合成方法。含有CnF2n+1部分的化合物可以通过氟硅胶柱进行纯化，用甲醇洗脱时释放含氟化合物。在过去的几十年里，这一方法已经被广泛地研究了各种化合物，Seeberger在20世纪90年代末发展起来的基于液相的微反应器应用于碳水化合物化学。固相合成因能快速实现化合物的分离而先后用于寡肽、寡核苷酸及寡糖的合成。但由于反应监测困难、非均相体系反应导致糖基化效率低等问题，使得糖的固相合成在具体应用时存在着诸多问题。而氟液相萃取及氟固相萃取技术能快速实现氟载体支载的化合物与非氟化合物的分离，而被广泛应用于多肽、寡糖以及其它有机化合物的合成中。由于氟载体支载的寡糖合成是在均相体系中进行的，其糖基化效率一般不会受影响。同时，反应可通过常规手段来监测，因此在较为复杂的寡糖合成中具有优势。但是，在氟液相萃取中需要使用昂贵的高氟代溶剂作为萃取剂；而F-SPE分离技术中繁杂的步骤既造成了化合物的损失，同时也限制了反应的规模。此外，重氟载体由于成本高，很难大规模使用，而目前报道的轻氟载体具有难脱除、难回收使用、负载量有限等问题。
技术实现思路
针对上述现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种氟标签及其制备方法、辅助的酶法合成寡糖链的方法。合成一类新型、成本较低、易回收使用的氟载体(氟标签、糖受体)，并在此基础上寻找一种能集固相、液相合成和酶法合成优点于一身的寡糖合成策略，对寡糖的合成有着极为重要的意义。为了解决以上技术问题，本专利技术的技术方案为：第一方面，一种氟标签，结构式如式Ⅰ所示，G-R(Ⅰ)。其中，G代表单糖或低聚糖；R为下列式Ⅱ、式Ⅲ中的一种：其中R1为C6H13、C8H17、中的一种。在本专利技术的一些实施方式中，G为下列结构式中的一种：在本专利技术的一些实施方式中，G表示乳糖时，R代表C8F17双氟链时如式Ⅱ所示所述式Ⅳ所示氟标签也称为氟载体、乳糖受体、二糖化合物。所述氟标签，具有脱除容易，易回收的优点。利用这种糖基受体去合成各种不同的寡糖链，实现快速高效的合成结构确定的寡糖链。第二方面，上述氟标签的制备方法，具体步骤为：1)乳糖与醋酐、醋酸钠回流反应，反应产物浓缩后萃取得到化合物12；2)化合物12与醋酸铵、甲醇/四氢呋喃反应、浓缩、纯化后，溶解在二氯甲烷中，加入三氯乙腈和DBU，反应后浓缩、纯化得到前步化合物，前步化合物与双氟链受体、活化的分子筛溶于二氯甲烷中反应，然后加入三氟甲磺酸三甲基硅酯继续反应，加入三乙胺终止反应，得到的产物经过过滤、浓缩、纯化得到化合物13；3)化合物13与甲醇、甲醇钠反应，将产物过滤、浓缩得到式Ⅰ所示化合物。可选的，步骤1)中反应的温度为150-170℃，反应的时间为5-7h；可选的，乳糖与醋酐、醋酸钠的比例为1g:5-6mL:0.9-1g。可选的，步骤2)中生成前步化合物先在温度为室温，反应的时间为7-9h，然后加入三氯乙腈和DBU后在室温下，反应的时间为0.6-1.2h；前步化合物与双氟链受体、分子筛后先在室温下反应15-25min，然后在-25～-35℃下反应5-15min；加入三氟甲磺酸三甲基硅酯后，在-25～-35℃下反应0.8-1.2h。可选的，化合物12、醋酸铵的质量比为5:2-2.5；前步化合物与双氟链受体、三氟甲磺酸三甲基硅酯的比为1g:2-2.5g:18-20μL。可选的，步骤3)中反应的温度为室温，反应的时间为1.5-2.5h，pH9-10。第三方面，上述氟标签在寡糖合成方面的应用。第四方面，上述的氟标签辅助的酶法合成寡糖链的方法，所述方法为：氟标签与酶法模块、糖基体进行组装反应，得到的产物经过氟固相萃取分离纯化、脱氟后得到寡糖链。合成寡糖链的方法，实现快速的寡糖链与非氟化合物的分离。在本专利技术的一些实施方式中，糖基体为N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰氨基半乳糖中的一种。在本专利技术的一些实施方式中，酶法模块包括酶法模块A、酶法模块B、酶法模块C、酶法模块D、酶法模块E，酶法模块A包括N-乙酰氨基己糖激酶(NahK)与糖核苷生成酶(GlmU)的融合酶(NahK/GlmU)以及β1-3N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶(HpLgtA)；酶法模块B包括半乳糖激酶(GalK)、糖核苷生成酶(BLUSP)以及β1-4半乳糖基转移酶(NmLgtB)；酶法模块C包括糖核苷生成酶(FKP)、α1-3岩藻糖基转移酶(Hpα1-3FucT)；酶法模块D包括糖核苷生成酶(NmCSS)、α2-3唾液酸转移酶(PmST1M144D)；酶法模块E包括N-乙酰氨基己糖激酶(NahK)与糖核苷生成酶(GlmU)的融合酶(NahK/GlmU)以及β1-3N-乙酰氨基半乳糖糖基转移酶(HiLgtD)；酶法模块F包括半乳糖激酶(GalK)、糖核苷生成酶(BLUSP)以及β1-3半乳糖基转移酶(CjCgtB)。在本专利技术的一些实施方式中，利用酶法模块A、N-乙酰氨基葡萄糖、氟标签(式Ⅳ)组装得到三糖化合物，三糖化合物的结构式如式Ⅴ所示：在本专利技术的一些实施方式中，利用式Ⅴ所示三糖化合物、半乳糖、酶法模块B组装得到四糖化合物，四糖化合物的结构式如式Ⅵ所示：在本专利技术的一些实施方式中，利用式Ⅵ所示四糖化合物、酶法模块A、N-乙酰氨基葡萄糖组装合成五糖化合物，五糖化合物的结构式如式Ⅶ所示：在本专利技术的一些实施方式中，利用式Ⅶ所示五糖化合物、半乳糖、酶法模块B组装得到六糖化合物，六糖化合物的结构式如本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氟标签，其特征在于：结构式如式Ⅰ所示，/nG-R(Ⅰ)；/n其中，G代表单糖或低聚糖；/nR为下列式Ⅱ、式Ⅲ中的一种：/n

【技术特征摘要】
1.一种氟标签，其特征在于：结构式如式Ⅰ所示，
G-R(Ⅰ)；
其中，G代表单糖或低聚糖；
R为下列式Ⅱ、式Ⅲ中的一种：



其中R1为C6H13、C8H17中的一种。


2.如权利要求1所述的氟标签，其特征在于：G为下列结构式中的一种：





3.如权利要求1所述的氟标签，其特征在于：G表示乳糖时，R代表C8F17双氟链时如式Ⅱ所示





4.如权利要求1-3任一所述的氟标签的制备方法，其特征在于：具体步骤为：
1)乳糖与醋酐、醋酸钠回流反应，反应产物浓缩后萃取得到化合物12；
2)化合物12与醋酸铵、甲醇/四氢呋喃反应、浓缩、纯化后，溶解在二氯甲烷中，加入三氯乙腈和DBU，反应后浓缩、纯化得到前步化合物，前步化合物与双氟链受体、活化的分子筛溶于二氯甲烷中反应，然后加入三氟甲磺酸三甲基硅酯继续反应，加入三乙胺终止反应，得到的产物经过过滤、浓缩、纯化得到化合物13；
3)化合物13与甲醇、甲醇钠反应，将产物过滤、浓缩得到式Ⅰ所示化合物；
可选的，步骤1)中反应的温度为150-170℃，反应的时间为5-7h；可选的，乳糖与醋酐、醋酸钠的比例为1g:5-6mL:0.9-1g；
可选的，步骤2)中生成前步化合物先在温度为室温，反应的时间为7-9h，然后加入三氯乙腈和DBU后在室温下，反应的时间为0.6-1.2h；前步化合物与双氟链受体、分子筛后先在室温下反应15-25min，然后在-25～-35℃下反应5-15min；加入三氟甲磺酸三甲基硅酯后，在-25～-35℃下反应0.8-1.2h；
可选的，化合物12、醋酸铵的质量比为5:2-2.5；前步化合物与双氟链受体、三氟甲磺酸三甲基硅酯的比为1g:2-2.5g:18-20μL；
可选的，步骤3)中反应的温度为室温，反应的时间为1.5-2.5h，pH9-10。


5.权利要求1-3任一所述的氟标签在寡糖合成方面的应用。


6.权利要求1-3任一所述的氟标签辅助的酶法合成寡糖链的方法，其特征在于：氟标签与酶法模块、糖基体进行组装反应，得到的产物为寡糖链；
可选的，糖基体为N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰氨基半乳糖中的一种；
可选的，酶法模块包括酶法模块A、酶法模块B、酶法模块C、酶法模块D、酶法模块E；
酶法模块A包括N-乙酰氨基己糖激酶与糖核苷生成酶的融合酶以及β1-3N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶；
酶法模块B包括半乳糖激酶、糖核苷生成酶以及β1-4半乳糖基转移酶；
酶法模块C包括糖核苷生成酶、...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹鸿志，方文元，刘长城，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37