海洋曲霉菌产生的抗真菌化合物及其制备方法技术

本发明专利技术属于医药生物领域，涉及采用共培养(又称混合培养)技术，从海洋来源的花斑曲霉菌的发酵产物中获得5个新结构抗真菌化合物(式I‑V所示)及其制备方法；本发明专利技术还涉及所述化合物抗真菌感染的应用。

【技术实现步骤摘要】
海洋曲霉菌产生的抗真菌化合物及其制备方法
：本专利技术属于医药生物领域，涉及采用共培养(又称混合培养)技术，从海洋来源的花斑曲霉菌的发酵产物中获得5个新结构抗真菌化合物(式I-V所示)及其制备方法；本专利技术还涉及所述化合物抗真菌感染的应用。
技术介绍
：海洋微生物是药物先导化合物发现的重要来源。真菌基因组通常携带有20～50种次级代谢生物合成基因。大多数次级代谢相关基因，在常规实验条件下，表达量极低或完全处于沉默状态，称为“沉默基因”。在自然环境中，不同种类的微生物(细菌、放线菌、真菌)共存于同一复杂体系。微生物之间通过产生代谢产物进行资源竞争、化学防御或信息交流。在共培养(混合培养)条件下，由于受到其它微生物的竞争压力，可能使处于沉默状态的基因得到激活，从而产生新的次级代谢产物。研究表明，共培养有助于增加微生物次级代谢产物的化学多样性，诱导产生良好的生物活性，其中最常见的是由化学防御机制产生的抗菌和细胞毒活性。本专利技术利用共培养技术，从来源于海洋花斑曲霉菌IMB17-055(Aspergillusversicolor)与其它真菌的共培养发酵液中，发现5个新结构的化合物，命名为共生霉素A-E(英文名称：cocultimycinA-E，如式I-V所示)。涉及式I-V所示化合物的化学结构、制备方法及抗真菌应用，迄今为止，尚未见有关报道。
技术实现思路
：本专利技术目的之一是，提供一株共生霉素A-E(cocultimycinA-E)的产生菌。该菌株为一种海洋真菌，优选为花斑曲霉菌IMB17-055，系分离自三亚红树林采集的海泥样品，为该菌株于2019年7月12日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：CGMCCNo.18107，建议的分类命名：花斑曲霉Aspergillusversicolor，参据的生物材料：IMB17-055。本专利技术目的之二是，提供五种新结构的化合物共生霉素I-V(如式I-V所示)。本专利技术从海洋真菌花斑曲霉菌IMB17-055(Aspergillusversicolor)与其它真菌的共培养发酵产物中发现5个新结构化合物，其结构如式I-V所示。分子式C41H71NO12,分子量770.0。分子式C41H71NO11,分子量754.0。分子式C41H69NO12,分子量768.0。分子式C41H73NO12,分子量772.0。分子式C35H61NO6,分子量591.9。本专利技术目的之三是，提供式I-V所示化合物共生霉素A-E的制备方法。本专利技术所述的式I-V所示化合物共生霉素A-E的制备方法，包括以下步骤：(1)将活化的保藏编号为CGMCCNo.18107的花斑曲霉菌IMB17-055和其它一种丝状真菌分别接种于马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)的发酵培养基中，制作种子液。随后，将两种菌株的种子液按等比例混合，然后转接于PDB发酵培养基中，进行共培养；(2)将共培养发酵产物过滤得到上清液和菌丝体，上清液用溶剂进行萃取，得到上清液提取物，菌丝体用溶剂超声提取，得到菌丝体提取物；(3)将上述两部分提取物合并，通过C18反相柱色谱分离，依次用10％、30％、50％、70％、100％甲醇溶液梯度洗脱。将100％洗脱组分经HPLC制备得到式I-V所示的化合物。优选的，本专利技术所述的化合物共生霉素A-E的制备方法，包括以下步骤：(1)将活化的保藏编号为CGMCCNo.18107的花斑曲霉菌IMB17-055与另外一种丝状真菌接种于配方为马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)的发酵培养基中，28℃，200r/min，摇瓶培养3天制作种子液。将两株菌的种子液按1:1的比例混合，随后按10％的接种量接种到装有100mLPDB发酵培养基的500mL锥形瓶中，28℃，200r/min震荡培养10天；(2)将共培养发酵产物过滤得到澄清发酵液和菌丝体，发酵液减压浓缩至5L后用乙酸乙酯进行萃取(5×5L)，得到上清液提取物(4g)。菌丝体用丙酮超声提取，得到菌丝体提取物(50g)；(3)通过C18反相闪式柱(55mm×400mm)色谱分离，依次用10％、30％、50％、70％、100％甲醇溶液梯度洗脱，得到14个馏分F1-F14。取100％洗脱组分经凝胶柱分离，然后经HPLC制备得到式I-V。其中，步骤(1)中，所述的液体培养基选自：包括但不限于PDB培养基。其中，步骤(1)中，所述的共培养(混合培养)所需的其它丝状真菌选自：包括但不限于青霉属、曲霉属、支顶孢属、枝孢属的任何菌株。其中，步骤(2)中，有机溶剂选自：氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙酸等碳链≤4的醇类、丙酮、丁酮、或以上溶剂的混合溶液。优选为，乙酸乙酯和丙酮。其中，步骤(3)中，馏分F1-F14别为10％、30％、50％、70％、100％浓度的有机溶剂依次洗脱得到；其中，所述溶剂选自：包括但不限于丙酮水溶液、碳链≤4的醇溶液、乙腈水溶液、或甲醇中一种或以上混合。其中，式I-V所示化合物的HPLC分离纯化过程如下：溶剂选自：丙酮水溶液、碳链≤4的醇溶液、乙腈水溶液。色谱柱选自：包括但不限于C18、C8、C3、苯基键合柱。优选为：C-18色谱柱，10mm×250mm,30％MeCN,4mL/min。进一步优选的，本专利技术所述的化合物共生霉素A-E的制备方法，包括以下步骤：(1)真菌IMB17-055(Aspergillusversicolor)共培养(混合培养)发酵：将活化的保藏编号为CGMCCNo.18107的花斑曲霉菌IMB17-055接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上，置于28℃恒温培养箱培养7-14天，用无菌铁铲取约1cm2的含菌琼脂块接种于100mL液体马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)发酵培养基，在500mL三角瓶中，28℃，200r/min，摇瓶培养3d制作种子液；采用以上相似实验过程，制备谢瓦氏曲霉菌IMB18-208的种子液。随后，将两种真菌的种子液进行等比例混合，按10％的接种量转接于PDB发酵培养基，28℃，200rpm震荡培养10天；(2)发酵产物的提取与浸膏的获得：将共培养发酵产物(30L)过滤得到发酵上清液和菌丝体，上清液减压浓缩至5L后用乙酸乙酯进行萃取(5×5L)，得到上清液提取物。菌丝体用丙酮超声提取，得到菌丝体提取物；(3)式I-V所示化合物的分离将上述提取物合并，通过C18反相闪式柱(55mm×400mm)色谱分离，依次用10％、30％、50％、70％、100％甲醇溶液梯度洗脱，得到14个洗脱馏分(F1-F14)。取100％洗脱组分F12经凝胶柱分离，得到5个馏分(F12-1-F12-5)，F12-2经HPLC色谱纯化(CapcellC18MG-Ⅱ5μm，20mm×250mm，50％乙腈-1‰甲酸水，10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.五种化合物共生霉素A-E，其特征在于，其结构如式I-V所示：/n

【技术特征摘要】
1.五种化合物共生霉素A-E，其特征在于，其结构如式I-V所示：





2.权利要求1所述共生霉素A-E的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将活化的保藏编号为CGMCCNo.18107的花斑曲霉菌IMB17-055与另外一种丝状真菌接种于配方为马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)的发酵培养基中，培养制备种子液，将两株菌的种子液等比例混合，随后按10％的接种量接种到装有PDB发酵培养基的锥形瓶中，进行共培养；
(2)将共培养发酵产物过滤得到上清液和菌丝体，上清液减压浓缩后用溶剂进行萃取，得到上清液提取物物，菌丝体用溶剂超声提取，得到菌丝体提取物；
(3)将上清液和菌丝体提取物合并，通过C18反相柱色谱分离，依次用10％、30％、50％、70％、100％甲醇溶液梯度洗脱，得到14个馏分(F1-F14)，取100％洗脱组分经凝胶柱分离，然后经HPLC制备得到式I-Ⅴ所示五个化合物。


3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的液体培养基包括但不限于PDB培养基。


4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的共培养所需的其它丝状真菌，包括但不限于青霉属、曲霉属、支顶孢属、枝孢属的任何菌株。


5.根据权利要求2所述的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：甘茂罗，李娇，陈明华，郝晓萌，李莎莎，李芳，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11