一种利用石竹子叶的组织培养方法及其在石竹遗传转化中的应用技术

本发明专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及一种利用石竹子叶的组织培养方法及其在石竹遗传转化中的应用，本发明专利技术提供的方法具有繁殖系数高，繁殖速度快，生根效果好，简单方便等特点，与用叶片进行组培快繁获取再生植株相比，其繁殖系数高，可达32~35，繁殖速度快，缩短了培养周期。不仅为石竹提供了一种快速繁殖生产技术，进行工厂化生产；同时利用这个再生方法进行遗传转化，也可以快速完成遗传转化，获得转基因植株，为进一步开展农杆菌介导的中国石竹转基因研究构建一个强有力的技术平台。

【技术实现步骤摘要】
一种利用石竹子叶的组织培养方法及其在石竹遗传转化中的应用
本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及一种利用石竹子叶的组织培养方法及其在石竹遗传转化中的应用。
技术介绍
中国石竹(Dianthuschinensis)属一二年生草本植物，起源于中国，被广泛用于鲜切花，花坛花境，园林绿化，丰富的花型有利于提高经济价值。近几年石竹的组培和快繁技术取得不少成果，然而，其再生率较低，且再生苗比较纤细，工业化组培快繁培养生产用苗困难。现有技术中，陈旭(2006)的毕业论文中介绍了利用叶片为外植体建立中国石竹的遗传转化体系其最佳再生条件为：离体的植物叶片在预培养基(MS基础培养基+2,4-D1.0mg/L+6-BA0.1mg/L)中培养3-4d，然后转入分化培养基(MS基础培养基+NAA0.3mg/L+6-BA1.0mg/L)，其再生率为68％，但受叶片状态的影响较大；2009年公布的专利《一种制备石竹高频再生植株的方法》(200910046388.8)中获取石竹再生植株的方法是借助原生质体的细胞全能性，然而获取原生质体的方法复杂，操作中需要用纤维素酶和果胶酶，耗费成本较高；张静静(2011)的毕业论文中详细的报道的先利用叶片诱导愈伤组织，进而分化出芽的遗传转化体系，转化效率较低，同时还介绍了叶片直接再生，再生率为56％，最佳分化培养基与陈旭报道的一致。施和平等(2013)发表的文章中报道了，五寸石竹(Dianthuschinensis)利用毛状根诱导及其植株再生的方法，其诱导植株再生培养基为：MS基础培养基+NAA0.02mg/L+6-BA1.0mg/L，30天可形成不定芽，但本方法需要先诱导足量毛状根的产生，然后对其进行脱分化获得愈伤组织，最后再分化成新的植株，过程复杂。获取再生植株的方式有很多种，然而不难发现，目前农杆菌介导的中国石竹的遗传转化，受组培苗叶片的状态影响很大，同时已报道的另一种方法，通过制备原生质体的诱导再生的方法花费高，效率低。然而，在其他物种中，如苏晓瑜(2007)在康乃馨中发现，接种不同部位的外植体，再生植株的再生率不同，同时将农杆菌转入不同的外植体，遗传转化效率也有很大差异。因此，筛选合适的外植体进行植株再生和遗传转化，提高再生率和诱导率，是亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种利用石竹(Dianthusspp.)子叶的组织培养方法，方法简单，易行，特别适用于石竹的遗传转化。本专利技术的另一个目的在于提供了石竹(Dianthusspp.)的组织培养方法在石竹遗传转化中的应用。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：石竹(Dianthusspp.)的组织培养方法：(1)外植体选取及处理：取真叶还未长出，子叶刚刚展开的石竹(Dianthusspp.)无菌苗，培养3-7天，光周期为光照14-16h，黑暗8-10h，光照强度1600-2000lux，取子叶刚刚由黄转绿无菌苗，用切去根和下胚轴，沿子叶中线切开，分离两片子叶，即得分离的子叶外植体；(2)增殖再生培养：将分离的子叶接种到增殖再生培养基：MS+6-BA0.8-1.2mg/L+NAA0.04-0.08mg/L+琼脂6.5-7.5g/L+蔗糖28-32g/L上进行增殖再生培养，pH值为5.8-6.8，接种时伤口紧贴于培养基上；温度24-28℃，光照15-16h/d，光照强度1800-2000lux，获得芽丛，芽丛上的芽单独切下在相同培养基和培养条件下继续进行增殖再生培养，扩繁植株；(3)壮芽培养：将获得的芽丛接种到壮芽培养基：MS+6-BA0.8-1.2mg/L+NAA0.3-0.4mg/L+琼脂6.5-7.5g/L+蔗糖28-32g/L,中进行壮芽培养，培养基pH值、培养温度、光照时间、光照强度均与(2)相同；(4)生根培养：芽丛上的不定苗长至3～5cm，具有2～4片完整的叶片时，切割成单株不定苗接种到生根培养基：MS+琼脂7.0-7.5g/L+蔗糖28-32g/L,中进行生根培养，培养基pH值、培养温度、光照时间、光照强度均与(2)相同；所述的石竹为杂交石竹(Dianthushybrid)或中国石竹(Dianthuschinensis)。上述石竹(Dianthuschinensis)的组织培养方法在石竹的遗传转化中的应用，其应用过程是利用本领域的常规方法，将携带有目的基因的农杆菌侵染子叶，再将其接种到共培养培养基中培养，然后接种至选择培养基培养，获得的抗性芽依次接种至壮芽培养基和生根培养基中；所述的共培养培养基：MS+6-BA0.8-1.2mg/L+NAA0.04-0.08mg/L+琼脂6.5-7.5g/L+蔗糖28-32g/L+AS80-120μmol/L，pH值为5.8-6.8；所述的选择培养基：MS+6-BA0.8-1.2mg/L+NAA0.04-0.08mg/L+琼脂6.5-7.5g/L+蔗糖28-32g/L+抗生素；所述的壮芽培养基：MS+6-BA0.8-1.2mg/L+NAA0.3-0.4mg/L+琼脂6.5-7.5g/L+蔗糖28-32g/L+抗生素；所述的生根培养基：MS+琼脂7.0-7.5g/L+蔗糖28-32g/L+抗生素；所述的抗生素为农杆菌转入的目的质粒携带的抗性基因对应的抗生素。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术提供一种利用石竹的子叶进行植物再生及遗传转化的方法，该方法繁殖系数高，繁殖速度快，生根效果好，简单方便等特点，与用叶片进行组培快繁获取再生植株相比，其繁殖系数高，可达32～35，繁殖速度快，缩短了培养周期。不仅为石竹提供了一种快速繁殖生产技术，进行工厂化生产；同时利用这个再生方法进行遗传转化，也可以快速完成遗传转化，获得转基因植株，为进一步开展农杆菌介导的中国石竹转基因研究构建一个强有力的技术平台。附图说明图1用于遗传转化的子叶。图2从子叶再生出的丛芽。图3再生芽在壮芽培养基的生长情况。图4转基因植株GFP检测。图5植株在生根培养基的生根情况。图6为阳性转化植株种植后示意图。图7部分T0代转化植株RT-PCR结果。具体实施方式本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：石竹(Dianthusspp.)的组织培养方法：(1)外植体选取及处理：外植体的子叶的获得：取发育饱满无病害的石竹(Dianthusspp.)种子，诱导发芽。所述诱导发芽是指将种子利用70％乙醇浸泡10min表面消毒，再用100％乙醇消毒10min，无菌水冲洗3-4次，每次4-5min。随后将种子接种于MS固体培养基，并转入暗培养箱。培养条件为25℃，培养3-5天，获得无菌苗。子叶的获得：取真叶还未长出，子叶刚刚展开的无菌苗，置于光下培养1天(光周期为光照16h，黑暗8h，光照强度1800lux)。取子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.石竹（

【技术特征摘要】
1.石竹（Dianthusspp.）的组织培养方法：
（1）外植体选取及处理：
取真叶还未长出，子叶刚刚展开的石竹无菌苗，培养3-7天，光周期为光照14-16h，黑暗8-10h，光照强度1600-2000lux，取子叶刚刚由黄转绿无菌苗，用切去根和下胚轴，沿子叶中线切开，分离两片子叶，即得分离的子叶外植体；
（2）增殖再生培养：将分离的子叶接种到增殖再生培养基：MS+6-BA0.8-1.2mg/L+NAA0.04-0.08mg/L+琼脂6.5-7.5g/L+蔗糖28-32g/L上进行增殖再生培养，pH值为5.8-6.8，接种时伤口紧贴于培养基上；温度24-28℃，光照15-16h/d，光照强度1800-2000lux，获得芽丛，芽丛上的芽单独切下在相同培养基和培养条件下继续进行增殖再生培养，扩繁植株；
（3）壮芽培养：将获得的芽丛接种到壮芽培养基：MS+6-BA0.8-1.2mg/L+NAA0.3-0.4mg/L+琼脂6.5-7.5g/L+蔗糖28-32g/L，中进行壮芽培养，培养基pH值、培养温度、光照时间、光照强度均与（2）相同；
（4）生根培养：芽丛上的不定苗长至3～5cm，具有2～4片完整的叶片时，切割成单株不定苗接种到生根培养基：MS+琼脂7.0-7.5g/L+蔗糖28-32g/L,中进行生根培...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅小鹏，张晓妮，吴全淑，林胜男，李谋亮，张震，包满珠，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42