一种菠萝抗寒种质的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种菠萝抗寒种质的制备方法，属于菠萝抗寒种质制备技术领域。本发明专利技术中的菠萝抗寒种质的制备方法，先将菠萝胚性悬浮细胞使用EMS进行诱变；然后将诱变后的胚性悬浮细胞于再生培养基上无菌培养30‑50天；然后调整温度至3‑7℃无菌培养4‑6天，获得存活的成熟胚；最后将存活的成熟胚进行生芽培养、生根培养，得增殖芽苗；然后调整温度至3‑7℃无菌培养增殖芽苗4‑6天；选择存活的增殖芽苗，即为菠萝抗寒种质。本发明专利技术中的方法，关键环节在实验室即可完成，实验条件可控；能够在短时间内对大量的菠萝个体进行抗寒能力筛选，能够快速筛选得到抗寒种质，能够明显加快菠萝抗寒育种的进度。

【技术实现步骤摘要】
一种菠萝抗寒种质的制备方法
本专利技术涉及一种菠萝抗寒种质的制备方法，属于菠萝抗寒种质制备

技术介绍
菠萝是多年生植物，原产于南美洲热带高温干旱地区，性喜温暖，适宜生长温度为28-32℃。菠萝根系对温度反应敏感，温度稳定在14℃以上是菠萝正常生长的条件。0℃是菠萝遭受严重寒害的临界温度。气温降至0℃，如果持续时间达1天以上，会造成植株新叶腐烂，根系冻死，果实萎缩腐烂。如果气温达-2℃，植株几乎死亡。低温能够诱导菠萝果实褐变水化，发生黑心病水心病。造成菠萝品质变差，销售困难。我国菠萝主产区为广东、海南、云南、福建、广西等省区。近几年多地区菠萝滞销，其中重要原因是因为前一年冬季气温过低造成菠萝果实出现黑心水心造成的。在一些地区，菠萝冬果曾遭黑心病危害达50％以上(贺军虎，菠萝新品种及优质高产栽培技术，中国农业科学出版社，2016年，第94页)，给农民带来了巨大的经济损失。针对菠萝主产区的低温灾害，培育抗寒菠萝新品种，对于菠萝产业的健康发展具有重要意义。由于菠萝自交不亲和，因此其一般是用冠芽、裔芽、吸芽及茎部等进行无性繁殖，这种无性繁殖非常不利于新品种的培育。在使用杂交育种培育新品种时，制备杂交种需要选育庞大的群体，需要付出极大的人力物力。而且由于自然条件下气温变化不定，针对杂交后代的选育具有极大的不确定性，因此，菠萝抗寒育种进展缓慢。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种菠萝抗寒种质的制备方法，该方法能快速的获得菠萝抗寒种质，大幅度缩短菠萝抗寒育种的进程。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种菠萝抗寒种质的制备方法，包括如下步骤：1)将菠萝胚性悬浮细胞使用EMS进行诱变；2)将诱变后的胚性悬浮细胞于再生培养基上无菌培养30-50天；然后调整温度至3-7℃无菌培养4-6天，获得存活的成熟胚；3)将步骤2)中存活的成熟胚进行生芽培养、生根培养，得增殖芽苗；然后调整温度至3-7℃无菌培养增殖芽苗4-6天；选择存活的增殖芽苗，即为菠萝抗寒种质。本专利技术中的菠萝抗寒种质的制备方法，先使用EMS(甲基磺酸乙酯)对菠萝胚性悬浮细胞进行诱变，然后在菠萝胚性悬浮细胞成苗过程中进行了两次抗寒筛选，一次在菠萝胚性悬浮细胞诱变后30-50天时，另一次在生芽生根培养后，诱导形成增殖芽苗后；两次分别在温度为3-7℃下无菌培养菠萝幼苗4-6天，然后选择存活的增殖芽苗，即为菠萝抗寒种质。本专利技术中的方法，关键环节在实验室即可完成，实验条件可控；能够在短时间内对大量的菠萝个体进行抗寒能力筛选，能够快速筛选得到抗寒种质。不仅能够节约大量的人力物力，而且能够控制处理条件，解决常规育种选育气候条件不确定的问题，能够明显加快菠萝抗寒育种的进度。优选的，步骤1)中所述菠萝胚性悬浮细胞是菠萝芽制备得到。所述菠萝芽为菠萝冠芽、裔芽、吸芽或块茎芽。可以使用的菠萝品种为台农4号、巴厘、金钻、甜蜜蜜或金菠萝的任意一种。优选的，步骤1)中所述诱变时EMS的浓度为0.005-0.01％。菠萝胚性悬浮细胞是单细胞或细胞串，选用高浓度的EMS容易杀死菠萝胚性悬浮细胞，造成不发芽。因此本专利技术中选择0.005-0.01％的诱导浓度。优选的，步骤1)中所述诱变的时间为12-18小时。优选的，步骤1)中所述菠萝胚性悬浮细胞的制备包括：a、取菠萝植株上的芽，消毒后于愈伤组织诱导培养基上暗培养，得到愈伤组织；b、选取愈伤组织中的胚性愈伤，于胚性悬浮细胞诱导液体培养基中暗培养，得到胚性悬浮细胞。优选的，步骤a中取菠萝植株上的芽的芽体茎段中间(厚度约0.4-0.6厘米)的片状部位，于愈伤组织诱导培养基上暗培养。在外植体材料选取上，本专利技术选择菠萝芽体茎段中间约0.5厘米厚度的部位，菠萝芽内生菌多，在组织培养时经常遇到外植体内生菌污染的情况，选用芽体茎段中间部位，能够有效避免这个问题。优选的，步骤a中于愈伤组织诱导培养基上暗培养50-70天，诱导得到愈伤组织。所述愈伤组织诱导培养基配方为MS+2.0mg/L2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)+1.5mg/L6-BA(6-苄氨基嘌呤)+0.1mg/LNAA(萘乙酸)+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH＝5.3。优选的，步骤b中所述胚性悬浮细胞诱导液体培养基为在MS培养基的基础上，添加1.5-2.5mg/L2,4-D、1-2mg/L6-BA、0.05-0.15mg/LNAA、40-50g/L蔗糖；所述胚性悬浮细胞诱导液体培养基的pH＝5.0-5.5。步骤b中于胚性细胞诱导液体培养基中暗培养50-70天，诱导得到胚性悬浮细胞。更为优选的，所述胚性悬浮细胞诱导液体培养基配方为MS+2mg/L2,4-D+1.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+45g/L蔗糖，pH＝5.3。优选的，步骤b在选择愈伤组织中的松脆易碎的胚性愈伤进行培养。在胚性愈伤转接到液体培养基以后，以每14天转接一次为宜，转接太频繁会增大被污染的几率，而且效果也不明显。转接时培养瓶内应保留10％-20％的原培养液不变。每次转接时，用移液器去除培养液内的黄色的分生组织小球、处于子叶期白色的胚、褐化坏死的组织和高度液泡化的细胞。优选的，步骤2)中所述再生培养基中添加以下物质：SH大量元素、SH微量元素、MS维生素、3.9-4.3μmol/L生物素、650-700μmol/L谷氨酰胺、1.5-2.5mmol/L脯氨酸、80-120mg/L麦芽糖、1.0-1.2μmol/LNAA、0.15-0.25μmol/L玉米素、0.3-0.7μmol/L激动素、0.5-0.9μmol/LN6-(2-isopentenyl)adenine、110-150mmol/L蔗糖、27-31mmol/L乳糖、0.8-1.2g/L植物凝胶；所述再生培养基的pH＝5.6-6.0。步骤2)中是将胚性悬浮细胞于再生培养基上暗培养30-60天，得到成熟胚。所述再生培养基为半固体培养基。再生培养基使用半固体培养基较好，铺在半固体培养基上面的滤纸能够更好地与培养基相接触，胚性悬浮细胞在滤纸上能够更容易地生长得到幼胚；而如果用全固体的培养基，则胚性悬浮细胞死亡率较高，生长出来的幼胚也呈现失水症状。更为优选的，所述再生培养基配方为SH大量元素+SH微量元素+MS维生素+4.1μmol/L生物素+680μmol/L谷氨酰胺+2mmol/L脯氨酸+100mg/L麦芽糖+1.1μmol/LNAA+0.2μmol/L玉米素+0.5μmol/L激动素+0.7μmol/LN6-(2-isopentenyl)adenine(异戊基腺嘌呤)+130mmol/L蔗糖+29mmol/L乳糖+1g/L植物凝胶，pH5.8。其中SH即SH培养基；MS即MS培养基；adenine即腺嘌呤。在转移胚性悬浮细胞时，在再生培养基的上面铺一张细胞载体，转移1mL上述胚性悬浮细胞培养物到细胞载体上，即可。所述细胞载体为滤纸，优选为无菌定性分析滤纸。在再生培养基上的培养为黑暗培养。优选的，步骤3)中所述生芽培养包括：将成熟胚于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种菠萝抗寒种质的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：/n1）将菠萝胚性悬浮细胞使用EMS进行诱变；/n2）将诱变后的胚性悬浮细胞于再生培养基上无菌培养30-50天；然后调整温度至3-7℃无菌培养4-6天，获得存活的成熟胚；/n3）将步骤2）中存活的成熟胚进行生芽培养、生根培养，得增殖芽苗；然后调整温度至3-7℃无菌培养增殖芽苗4-6天；选择存活的增殖芽苗，即为菠萝抗寒种质。/n

【技术特征摘要】
1.一种菠萝抗寒种质的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）将菠萝胚性悬浮细胞使用EMS进行诱变；
2）将诱变后的胚性悬浮细胞于再生培养基上无菌培养30-50天；然后调整温度至3-7℃无菌培养4-6天，获得存活的成熟胚；
3）将步骤2）中存活的成熟胚进行生芽培养、生根培养，得增殖芽苗；然后调整温度至3-7℃无菌培养增殖芽苗4-6天；选择存活的增殖芽苗，即为菠萝抗寒种质。


2.根据权利要求1所述的菠萝抗寒种质的制备方法，其特征在于：步骤1）中所述诱变时EMS的浓度为0.005-0.01%。


3.根据权利要求2所述的菠萝抗寒种质的制备方法，其特征在于：所述诱变的时间为12-18小时。


4.根据权利要求1所述的菠萝抗寒种质的制备方法，其特征在于：步骤1）中所述菠萝胚性悬浮细胞的制备包括：a、取菠萝植株上的芽，消毒后于愈伤组织诱导培养基上暗培养，得到愈伤组织；b、选取愈伤组织中的胚性愈伤，于胚性悬浮细胞诱导液体培养基中暗培养，得到胚性悬浮细胞。


5.根据权利要求4所述的菠萝抗寒种质的制备方法，其特征在于：所述胚性悬浮细胞诱导液体培养基为在MS培养基的基础上，添加1.5-2.5mg/L2,4-D、1-2mg/L6-BA、0.05-0.15mg/LNAA、40-50g/L蔗糖；所述胚性悬浮细胞诱导液体培养基的pH=5.0-5.5。


6.根据权利要求4所述的菠萝抗寒种质的制备方法，其特征在于：步骤b中于胚性悬浮细胞诱导液体培养基中暗培养50-70天，诱导得到胚性悬浮细胞。


7.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：常胜合，舒海燕，孙威，李科明，许桂莺，詹儒林，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院海口实验站，
类型：发明
国别省市：海南;46