一种菠萝组织培养苗的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种菠萝组织培养苗的制备方法，属于菠萝组培苗制备技术领域。本发明专利技术中的菠萝组织培养苗的制备方法，取菠萝植株上的芽诱导产生胚性愈伤，然后建立胚性悬浮细胞系，利用胚性悬浮细胞系再生获得菠萝组织培养苗。本发明专利技术中的方法繁殖系数大，一个芽体通过愈伤组织和悬浮细胞系能够获得数万个独立的细胞，这些独立的细胞在合适条件下都能够单独发育成一个单独的植株；另一方面悬浮细胞容易保存，当需要某一个品种的种苗时，应用保存的悬浮细胞系，很快就可以再生生成相应的种苗，缩短了菠萝种苗的培养时间，有效提高了菠萝种苗的可持续供应。

【技术实现步骤摘要】
一种菠萝组织培养苗的制备方法
本专利技术涉及一种菠萝组织培养苗的制备方法，属于菠萝组培苗制备

技术介绍
菠萝是海南省主要的热带水果，在海南省经济发展中的地位举足轻重。海南省光热资源充沛，发展菠萝产业具有得天独厚的优势。目前海南省菠萝主栽品种之一是巴厘，其催花容易，管理简单；但是品质不高，效益低，上市时间集中，近几年多次出现滞销的情况。因此，菠萝种植户已经倾向于用经济效益高的新品种代替巴里菠萝；获得足够多的菠萝新品种优质种苗是实现品种更新换代的前提。目前生产上菠萝种苗一般有吸芽、冠芽、裔芽、组培苗四种。其中吸芽是母株处于最旺盛阶段所抽生的芽体。用吸芽繁殖，定植后生长快，结果早，果中等个，可溶性固形物含量高。用作种苗的吸芽要充分成熟，叶身变硬、开张，长达25-35厘米，剥去基部叶片后，显出褐色小根点时，即为成熟的表现。一般在采果后喷施根外肥和雨后撒施速效肥，吸芽长至能做种苗时取出，摘下即可作为种苗使用。用冠芽繁殖的植株果大，开花整齐，成熟期比较一致。摘除冠芽的时间是：芽长20厘米，叶身变硬，上部开张，有有根出现时即可摘下。裔芽发生多影响果实发育，应该分批摘除。为繁殖种苗可以适当保留2-3个，采果后留在果柄上的小裔芽仍然能够继续生长，待长达18-20厘米时摘下栽植。这三种方法都是从结果植株上直接采集芽体。繁殖系数小，可以获得的种苗少。例如每个母株上可以获得大苗仅为6-8个。每个母株上的冠芽仅为1个。每个母株上裔芽仅有2-3个。大规模品种更新换代要求有足够多的新品种优质种苗依靠；而吸芽、冠芽、裔芽繁殖菠萝的数量少、速率满，显然不能够满足大规模更新换代菠萝品种的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种菠萝组织培养苗的制备方法，该方法能够大幅度提高菠萝种苗的组培苗的培养效率。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种菠萝组织培养苗的制备方法，包括如下步骤：1)取菠萝植株上的芽，消毒后于愈伤组织诱导培养基上暗培养，得到愈伤组织；2)选取步骤1)中的愈伤组织中的胚性愈伤，于胚性悬浮细胞诱导液体培养基中暗培养，得到胚性悬浮细胞；3)将步骤2)中的胚性悬浮细胞于再生培养基上暗培养，得到成熟胚；所述再生培养基为半固体培养基，所述再生培养基上铺设有细胞载体，胚性悬浮细胞置于细胞载体上进行培养；4)将步骤3)中成熟胚进行生芽培养和生根培养，得增殖芽苗，即为菠萝组织培养苗。本专利技术中的菠萝组织培养苗的制备方法，通过诱导胚性愈伤，然后建立胚性悬浮细胞系，利用胚性悬浮细胞系再生获得菠萝组织培养苗。该方法繁殖系数大，一个芽体通过愈伤组织和悬浮细胞系能够获得数万个独立的细胞，这些独立的细胞在合适条件下都能够单独发育成一个单独的植株；另一方面悬浮细胞容易保存，当需要某一个品种的种苗时，应用保存的悬浮细胞系，很快就可以再生生成相应的种苗，缩短了菠萝种苗的培养时间，有效提高了菠萝种苗的可持续供应。优选的，步骤1)中所述芽为冠芽、裔芽、吸芽或块茎芽。优选的，步骤1)中取菠萝植株上的芽的芽体茎段中间(厚度约0.4-0.6厘米)的片状部位，于愈伤组织诱导培养基上暗培养。在外植体材料选取上，本专利技术选择菠萝芽体茎段中间约0.5厘米厚度的部位，菠萝芽内生菌多，在组织培养时经常遇到外植体内生菌污染的情况，选用芽体茎段中间部位，能够有效避免这个问题。优选的，步骤1)中于愈伤组织诱导培养基上暗培养50-70天，诱导得到愈伤组织。所述愈伤组织诱导培养基配方为MS+2.0mg/L2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)+1.5mg/L6-BA(6-苄氨基嘌呤)+0.1mg/LNAA(萘乙酸)+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH＝5.3。优选的，步骤2)中所述胚性悬浮细胞诱导液体培养基为在MS培养基的基础上，添加1.5-2.5mg/L2,4-D、1-2mg/L6-BA、0.05-0.15mg/LNAA、40-50g/L蔗糖；所述胚性悬浮细胞诱导液体培养基的pH＝5.0-5.5。步骤2)中于胚性细胞诱导液体培养基中暗培养50-70天，诱导得到胚性悬浮细胞。更为优选的，所述胚性悬浮细胞诱导液体培养基配方为MS+2mg/L2,4-D+1.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+45g/L蔗糖，pH＝5.3。优选的，步骤2)在选择愈伤组织中的松脆易碎的胚性愈伤进行培养。在胚性愈伤转接到液体培养基以后，以每14天转接一次为宜，转接太频繁会增大被污染的几率，而且效果也不明显。转接时培养瓶内应保留10％-20％的原培养液不变。每次转接时，用移液器去除培养液内的黄色的分生组织小球、处于子叶期白色的胚、褐化坏死的组织和高度液泡化的细胞。优选的，步骤3)中所述再生培养基中添加以下物质：SH大量元素、SH微量元素、MS维生素、3.9-4.3μmol/L生物素、650-700μmol/L谷氨酰胺、1.5-2.5mmol/L脯氨酸、80-120mg/L麦芽糖、1.0-1.2μmol/LNAA、0.15-0.25μmol/L玉米素、0.3-0.7μmol/L激动素、0.5-0.9μmol/LN6-(2-isopentenyl)adenine、110-150mmol/L蔗糖、27-31mmol/L乳糖、0.8-1.2g/L植物凝胶；所述再生培养基的pH＝5.6-6.0。步骤3)中是将胚性悬浮细胞于再生培养基上暗培养30-60天，得到成熟胚。所述再生培养基为半固体培养基。再生培养基使用半固体培养基较好，铺在半固体培养基上面的滤纸能够更好地与培养基相接触，胚性悬浮细胞在滤纸上能够更容易地生长得到幼胚；而如果用全固体的培养基，则胚性悬浮细胞死亡率较高，生长出来的幼胚也呈现失水症状。更为优选的，所述再生培养基配方为SH大量元素+SH微量元素+MS维生素+4.1μmol/L生物素+680μmol/L谷氨酰胺+2mmol/L脯氨酸+100mg/L麦芽糖+1.1μmol/LNAA+0.2μmol/L玉米素+0.5μmol/L激动素+0.7μmol/LN6-(2-isopentenyl)adenine(异戊基腺嘌呤)+130mmol/L蔗糖+29mmol/L乳糖+1g/L植物凝胶，pH5.8。其中SH即SH培养基；MS即MS培养基；adenine即腺嘌呤。在转移胚性悬浮细胞时，在再生培养基的上面铺一张细胞载体，转移1mL上述胚性悬浮细胞培养物到细胞载体上，即可。所述细胞载体为滤纸，优选为无菌定性分析滤纸。优选的，步骤4)中所述生芽培养包括：将成熟胚于第一生芽培养基上暗培养，得到发芽的胚；将发芽的胚转移到第二生芽培养基上培养，得到从生芽；将从生芽中的小苗取出于芽苗恢复培养基上培养，得到幼芽，然后将幼芽进行生根培养。优选的，所述第一生芽培养基中添加以下物质：MS培养基、1.5-2.5mg/LIAA、0.3-0.7mg/LBAP、25-35g/L蔗糖、2.5-3.5g/L植物凝胶；所述第一生芽培养基的pH＝5.6-6.0。然后将成熟胚于第一生芽培养基上黑暗培养20-40天，得到发芽的胚本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种菠萝组织培养苗的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：/n1）取菠萝植株上的芽，消毒后于愈伤组织诱导培养基上暗培养，得到愈伤组织；/n2）选取步骤1）中的愈伤组织中的胚性愈伤，于胚性悬浮细胞诱导液体培养基中暗培养，得到胚性悬浮细胞；/n3）将步骤2）中的胚性悬浮细胞于再生培养基上暗培养，得到成熟胚；所述再生培养基为半固体培养基，所述再生培养基上铺设有细胞载体，胚性悬浮细胞置于细胞载体上进行培养；/n4）将步骤3）中成熟胚进行生芽培养和生根培养，得增殖芽苗，即为菠萝组织培养苗。/n

【技术特征摘要】
1.一种菠萝组织培养苗的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）取菠萝植株上的芽，消毒后于愈伤组织诱导培养基上暗培养，得到愈伤组织；
2）选取步骤1）中的愈伤组织中的胚性愈伤，于胚性悬浮细胞诱导液体培养基中暗培养，得到胚性悬浮细胞；
3）将步骤2）中的胚性悬浮细胞于再生培养基上暗培养，得到成熟胚；所述再生培养基为半固体培养基，所述再生培养基上铺设有细胞载体，胚性悬浮细胞置于细胞载体上进行培养；
4）将步骤3）中成熟胚进行生芽培养和生根培养，得增殖芽苗，即为菠萝组织培养苗。


2.根据权利要求1所述的菠萝组织培养苗的制备方法，其特征在于：步骤1）中于愈伤组织诱导培养基上暗培养50-70天，诱导得到愈伤组织。


3.根据权利要求1或2所述的菠萝组织培养苗的制备方法，其特征在于：步骤2）中所述胚性悬浮细胞诱导液体培养基为在MS培养基的基础上，添加1.5-2.5mg/L2,4-D、1-2mg/L6-BA、0.05-0.15mg/LNAA、40-50g/L蔗糖；所述胚性悬浮细胞诱导液体培养基的pH=5.0-5.5。


4.根据权利要求3所述的菠萝组织培养苗的制备方法，其特征在于：步骤2）中于胚性悬浮细胞诱导液体培养基中暗培养50-70天，诱导得到胚性悬浮细胞。


5.根据权利要求1所述的菠萝组织培养苗的制备方法，其特征在于：步骤3）中所述再生培养基中添加以下物质：SH大量元素、SH微量元素、MS维生素、3.9-4.3µmol/L生物素、650-700µmol/L谷氨酰胺、1.5-2.5mmol/L脯氨酸、80-120mg/L麦芽糖、1.0-1.2µ...

【专利技术属性】
技术研发人员：常胜合，舒海燕，李科明，孙威，许桂莺，郭刚，詹儒林，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院海口实验站，
类型：发明
国别省市：海南;46