【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】由冷冻保存的肿瘤样品扩增TIL
相关申请
[0001]本国际PCT申请要求2018年9月20日提交的美国临时专利申请号62/733,937和2019年7月29日提交的美国临时专利申请号62/879,881的优先权，其全部内容各自通过引用并入本文。
[0002]本文所述的专利技术总体上涉及淋巴细胞的扩增，更具体但非排他地涉及由冷冻保存的肿瘤组织扩增淋巴细胞。
技术介绍
[0003]使用过继性转移的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL，tumor infiltrating lymphocyte)治疗难治性的癌症代表了一种治疗预后不良患者的潜在有效方法。Gattinoni等，Nat.Rev.Immunol.，2006，6，383
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393。成功的免疫治疗需要大量的TIL；因此，生产和商业化需要稳健可靠的方法。由于细胞扩增的众多技术、物流和监管问题，此种商业化扩增一直是一项严峻的挑战。由于其效率，基于IL
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2的TIL扩增随后进行“快速扩增过程”(REP，rapid expansion pro...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种冷冻保存肿瘤组织以生产肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：(i)破碎肿瘤组织；(ii)在冷冻保存培养基中孵育碎片；以及(iii)冷冻碎片，其中，所述冷冻是使用液氮的蒸汽相进行的速冻。2.根据权利要求1所述的方法，其中，将肿瘤组织破碎成直径为约1.5mm至6mm的近似球形的碎片。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述近似球形的碎片的直径为约6mm。4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述近似球形的碎片的直径为约3mm。5.根据权利要求1所述的方法，其中，将肿瘤组织破碎成最短边缘长度为至少1.5mm、最长边缘长度为约6mm的大致矩形的碎片。6.根据权利要求1所述的方法，其中，将肿瘤组织破碎成边缘长度为约1.5mm至约6mm的大致立方体的碎片。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述大致立方体的碎片的边缘长度为约6mm。8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述大致立方体的碎片的边缘长度为约3mm。9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肿瘤组织来自解剖的肿瘤。10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述解剖的肿瘤为不到8小时大。11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述冷冻保存培养基包含2％v/v至15％v/v的二甲基亚砜(DMSO)。12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述冷冻保存培养基包含约10％v/v DMSO。13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述冷冻保存培养基包含至少一种抗微生物剂。14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述至少一种抗微生物剂是浓度为至少50μg/mL的庆大霉素。15.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述冷冻保存培养基中孵育所述肿瘤碎片约30分钟至约80分钟。16.根据权利要求1所述的方法，其中，在约2℃至8℃的温度下在所述冷冻保存培养基中孵育所述肿瘤碎片。17.根据权利要求1所述的方法，其中，在孵育之前，用生理缓冲等渗盐溶液洗涤所述肿瘤组织。18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述洗涤包括三次连续洗涤、每次洗涤至少三分钟，每次连续洗涤后均更换生理缓冲等渗盐溶液。19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述冷冻在
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125℃至约
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196℃的温度下进行。20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述冷冻在约
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140℃至约
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175℃的温度下进行。21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述冷冻在约
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145℃的温度下进行。22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括步骤(iv)：将冷冻的碎片储存在低于至少
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130℃下。23.根据权利要求22所述的方法，其中，将冷冻的碎片储存在液氮的蒸汽相中。24.根据权利要求22所述的方法，其中，将冷冻的碎片浸没在液氮中储存。25.一种用于制备肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的冷冻保存的肿瘤碎片，所述冷冻保存的肿
瘤碎片通过包括以下步骤的方法制备：(i)破碎解剖的肿瘤或肿瘤活检样品；(ii)在冷冻保存培养基中孵育碎片；以及(iii)冷冻碎片，其中，所述冷冻是使用液氮的蒸汽相进行的速冻。26.根据权利要求25所述的通过所述方法制备的用于制备肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的冷冻保存的肿瘤碎片，其中，步骤(ii)还包括：在约2℃至约8℃下，在包含10％v/v DMSO的冷冻保存培养基中孵育碎片约30分钟至约60分钟。27.一种用于制备肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的冷冻保存的肿瘤碎片，所述冷冻保存的肿瘤碎片通过包括以下步骤的方法制备：(i)破碎解剖的肿瘤，其中，碎片为大致立方体形且每个边缘为约6mm；(ii)在冷冻保存培养基中孵育碎片，所述冷冻保存培养基包含10％DMSO v/v，其中，所述孵育在约2℃至约8℃的温度下进行约30分钟至约60分钟；以及(iii)冷冻碎片，其中，所述冷冻是使用液氮的蒸汽相进行的速冻。28.一种制备用于过继性T细胞治疗的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括在包含IL
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2的培养基中培养冷冻保存的肿瘤碎片。29.一种制备用于过继性T细胞治疗的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：(a)在透气容器中用包含白细胞介素2(IL
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2)和可选的OKT
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3抗体的第一细胞培养基处理冷冻保存的肿瘤碎片，产生TIL；(b)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT
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3抗体和IL
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2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL；以及(c)可选地冷冻保存所述扩大数量的TIL。30.一种制备用于过继性T细胞治疗的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：(a)以冷冻状态储存肿瘤组织，储存肿瘤组织的方法包括：(i)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；(ii)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；(iii)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约30分钟至约60分钟；(iv)冷冻容器，其中，所述冷冻是使用液氮的蒸汽相进行的速冻；以及(v)将容器储存在
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130℃以下；(b)解冻容器；(c)在透气容器中用包含白细胞介素2(IL
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2)和可选的OKT
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3的第一细胞培养基处理肿瘤组织，产生TIL；(d)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT
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3和IL
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2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。31.根据权利要求30所述的方法，其中，将步骤(i)中的肿瘤组织修剪成直径为1.5mm至6mm。32.根据权利要求31所述的方法，其中，将步骤(i)中的肿瘤组织修剪成约6mm
×
6mm
×
6mm。33.根据权利要求30至32中任一项所述的方法，其中，所述储存培养基还包含抗细菌剂
和抗真菌剂。34.根据权利要求30至33中任一项所述的方法，其中，所述储存培养基包含2％v/v至12％v/v的二甲基亚砜(DMSO)。35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述储存培养基包含10％的DMSO。36.根据权利要求30至35中任一项所述的方法，其中，所述储存培养基包含浓度为至少50μg/mL的庆大霉素。37.根据权利要求30至36中任一项所述的方法，其中，在进行步骤(i)之前，先用Hank平衡盐溶液(HBSS)洗涤肿瘤组织。38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述洗涤包括三次连续洗涤、每次洗涤至少三分钟，在每次连续洗涤之后更换HBSS。39.根据权利要求30至38中任一项所述的方法，其中，步骤(b)包括将所述容器浸入约37℃水浴中约5分钟。40.根据权利要求1或30所述的方法，其中，所述肿瘤组织选自：黑色素瘤肿瘤组织、头颈肿瘤组织、乳腺肿瘤组织、肾肿瘤组织、胰腺肿瘤组织、胶质母细胞瘤肿瘤组织、肺肿瘤组织、结直肠肿瘤组织、肉瘤肿瘤组织、三阴性乳腺肿瘤组织、宫颈肿瘤组织、卵巢肿瘤组织或HPV阳性肿瘤组织。41.根据权利要求30所述的方法，其中，所述方法还包括在第一次扩增步骤(c)和第二次扩增步骤(e)之间的分装。42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述分装发生在步骤(c)开始后约16天。43.根据权利要求30至42中任一项所述的方法，其中，所述第一次培养步骤为约11天。44.根据权利要求30至42中任一项所述的方法，其中，步骤(c)至步骤(e)进行约22天的时间。45.根据权利要求30至42中任一项所述的方法，其中，步骤(c)至步骤(e)进行少于20天的时间。46.根据权利要求30所述的方法，其中，步骤(iv)包括在约
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125℃至约
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150℃下冷冻容器。47.根据权利要求30所述的方法，其中，步骤(iv)包括使用液氮的蒸汽相冷冻容器。48.根据权利要求30所述的方法，其中，步骤(v)包括将容器储存在低于至少约
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130℃下。49.根据权利要求30所述的方法，其中，步骤(v)包括将容器浸没在液氮中储存。50.一种制备用于过继性T细胞治疗的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：(a)以冷冻状态储存肿瘤组织，储存肿瘤组织的方法包括：(i)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；(ii)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；(iii)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约30分钟；(iv)使用液氮的蒸汽相冷冻容器；以及(v)在液氮温度的蒸汽相下储存容器；(b)解冻容器；(c)在透气容器中用包含白细胞介素2(IL
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2)和可选的OKT
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3的第一细胞培养基处理肿
瘤组织，产生TIL；(d)取出至少多个TIL；(e)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT
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3和IL
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2的第二细胞...
【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：艾欧凡斯生物治疗公司，
类型：发明
国别省市：
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