人羊膜干细胞培养物的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及生物医学技术领域，公开了人羊膜干细胞培养物的制备方法，首先将分离提取的人羊膜干细胞用人羊膜干细胞培养基进行培养，当人羊膜干细胞扩增至细胞汇合度为90％时，改换无血清培养基对人羊膜干细胞继续培养48小时，然后收集上清(即培养物)，并浓缩10倍，即人羊膜干细胞培养物；本发明专利技术还公开了应用。本发明专利技术首次发现并证实，人羊膜干细胞培养物具有美白皮肤、提亮肤色、保持皮肤健康自然的功效，对由内分泌失调引起或化学物质刺激引起或物理方法刺激引起的黑色素沉积具有很好的预防和治疗效果，且成分安全，无免疫排斥及致瘤作用，对人体无明显毒副作用，且制备方法简单，操作过程可控，具有重要的产业化价值。具有重要的产业化价值。具有重要的产业化价值。

【技术实现步骤摘要】
人羊膜干细胞培养物的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物医学
，具体涉及人羊膜干细胞培养物的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]黑色素沉积是异常增多的黑色素在皮肤的某些部位过量沉着，进而形成色素斑、老年斑等。紫外线照射、内分泌失调、不良生活习惯等可导致皮肤弹性减退、色素沉着以及整体肤色偏黑偏暗，严重影响人体皮肤美观，特别是在“以白为美”的亚洲文化影响下，肤色白皙在审美中占有非常重要的位置。因此，全球美白护肤市场巨大，在功效型护肤品上，美白淡斑的比例是最高的，很多跨国公司仅销售美白产品，年收益就可达数亿美元。所以，寻找具有抑制黑色素沉积和美白功效的成分已成为科学研究和产品开发的热点。
[0003]黑色素形成是一个复杂的生物化学过程，黑色素合成与降解的不平衡是导致色素沉着的主要原因。酪氨酸酶在黑色素合成过程中发挥着至关重要的作用，因此，抑制酪氨酸酶的表达和活性已成为抑制黑色素沉积的最有效方法。目前，市面上最常见的美白剂有曲酸、熊果苷和维生素C等酪氨酸酶抑制剂，它们可以减少黑色素中间体被氧化的数量。此外，α
‑
羟基酸也常被用于皮肤美白。然而，这些化合物均存在如下明显的缺点：曲酸具有致敏性和潜在的致癌风险，熊果苷为氢醌衍生物，氢醌在酪氨酸酶的作用下被氧化成有毒性的半醌物质，会引起皮肤红斑、脱屑、瘙痒、刺痛、过敏，甚至引起皮肤永久性损害，并具有致癌性；维生素C衍生物仅在高浓度下有效果，并且其在化妆品配方中很难稳定存在；α
‑
羟基酸具有很强的刺激性。相比较，目前上没有促进黑色素降解的制剂产品。
[0004]综上所述，目前亟需寻找一种可应用于美白护肤产品中且安全有效的新型美白制剂。

技术实现思路

[0005]基于以上问题，本专利技术提供人羊膜干细胞培养物的制备方法及应用，本专利技术无免疫排斥及致瘤作用，弥补了市面上美白产品致敏性高、致癌风险大的缺陷，填补了美白市场空缺，明显优于市面上护肤品中的美白添加剂，优势突出。
[0006]为解决以上技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：
[0007]人羊膜干细胞培养物的制备方法，具体制备方法如下：
[0008]a.将人羊膜干细胞接种在含有完全培养基的细胞培养皿中培养，待细胞汇合度为90％时，弃掉完全培养基；
[0009]b.用PBS清洗3次，然后加入DMEM无血清培养基继续培养48h；
[0010]c.收集上清，即初获人羊膜干细胞培养物，在4℃、1000rpm条件下离心3min去除细胞碎片；
[0011]d.将上清置于蛋白浓缩管中，在4℃、4500g、70min的条件下，离心浓缩，获得的最终浓缩物即为人羊膜干细胞培养物，放置于
‑
80℃保存、待用。
[0012]进一步的，步骤c中收集上清时，DMEM无血清培养基中的细胞密度至少为2x 105个/mL，步骤d中的浓缩倍数为10倍。
[0013]进一步的，所述人羊膜干细胞为人羊膜上皮干细胞或人羊膜间充质干细胞。
[0014]为解决以上技术问题，本专利技术还提供了人羊膜干细胞培养物在制备美白护肤产品中的应用。
[0015]进一步的，所述美白护肤产品可用于抑制由内分泌失调引起或化学物质刺激引起或物理方法刺激引起的黑色素沉积，其抑制机制为抑制黑色素合成和促进黑色素降解。
[0016]进一步的，所述化学物质为α
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促黑色素细胞激素，所述物理方法为紫外线照射。
[0017]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术的干细胞培养物中的活性成分具有美白皮肤、提亮肤色、保持皮肤健康自然的功效，对由内分泌失调引起或化学物质刺激引起或物理方法刺激引起的黑色素沉积具有很好的预防和治疗效果，且成分安全，无免疫排斥及致瘤作用，对人体无明显毒副作用，弥补了市面上美白产品致敏性高、致癌风险大的缺陷，填补了美白市场空缺，明显优于市面上护肤品中的美白添加剂，优势突出，且制备方法简单，操作过程可控，具有重要的产业化价值。
附图说明
[0018]图1为本专利技术的实施例的人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮干细胞抑制黑色素分泌量的平板对照图和柱状图；
[0019]图2为本专利技术的实施例的人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮干细胞抑制黑色素含量的示意图和柱状图；
[0020]图3为本专利技术的实施例的人羊膜间充质干细胞条件培养基和人羊膜上皮干细胞条件培养基(细胞密度为2
×
105个细胞/mL)抑制黑色素分泌量和含量的柱状图；
[0021]图4为本专利技术的实施例的不同浓度的人羊膜间充质干细胞条件培养基和上皮干细胞条件培养基对黑色素分泌量的抑制作用结果图；
[0022]图5为本专利技术的实施例的不同浓度的人羊膜间充质干细胞条件培养基和上皮干细胞条件培养基对黑色素含量的抑制作用结果图；
[0023]图6为本专利技术的实施例的人羊膜间充质干细胞条件培养基和人羊膜上皮干细胞条件培养基对酪氨酸酶活性抑制率测试结果图；
[0024]图7为本专利技术的实施例的表观色度对照图；
[0025]图8为本专利技术的实施例的表观亮度(L值)对照图。
具体实施方式
[0026]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本专利技术作进一步的详细说明，本专利技术的示意性实施方式及其说明仅用于解释本专利技术，并不作为对本专利技术的限定。
[0027]实施例：
[0028]本实施例从人分娩后的羊膜中分离、纯化获得人羊膜干细胞，包括人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮干细胞，经体外培养后收集含有多种干细胞分泌因子的上清，并经过适当浓缩及其它处理后得最终的人羊膜干细胞培养物。
[0029]人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮干细胞的分离提取方法如下：
[0030]1)在无菌条件下，将人羊膜从分娩后的人胎盘组织中剥离，并用含有1％双抗(青霉素/链霉素)的D
‑
Hank's液进行清洗，去除羊膜上的血丝和粘稠物；
[0031]2)将清洗后的羊膜剪碎，加入胰酶，在37℃条件下消化45分钟至羊膜变白；
[0032]3)取上清，离心1500rpm，5分钟；
[0033]4)取沉淀，用人羊膜上皮细胞培养基重悬，清洗，离心1500rpm，5分钟；
[0034]5)重复步骤(4)；
[0035]6)取沉淀，即人羊膜上皮干细胞(hAESCs)；
[0036]7)剩余的羊膜经胰酶继续消化45分钟，彻底清除残余的人羊膜上皮干细胞；
[0037]8)剩余的羊膜经胶原酶4继续消化至组织融化，呈粘稠状；
[0038]9)用200目的筛网过滤，收集滤液，离心3000rpm，5分钟；
[0039]10)取沉淀，用羊膜间充质干细胞培养基重悬、清洗，离心1000rpm，3min；
[0040]11)重复步骤(10)；
[0041]12)取沉淀，用羊膜间充质干细胞培养基重悬，铺板，根据分离原代人羊本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.人羊膜干细胞培养物的制备方法，其特征在于，具体制备方法如下：a.将人羊膜干细胞接种在含有完全培养基的细胞培养皿中培养，待细胞汇合度为90％时，弃掉完全培养基；b.用PBS清洗3次，然后加入DMEM无血清培养基继续培养48h；c.收集上清，即初获人羊膜干细胞培养物，在4℃、1000rpm条件下离心3min去除细胞碎片；d.将上清置于蛋白浓缩管中，在4℃、4500g、70min的条件下，离心浓缩，获得的最终浓缩物即为人羊膜干细胞培养物，放置于
‑
80℃保存、待用。2.根据权利要求1所述的人羊膜干细胞培养物的制备方法，其特征在于，步骤c中收集上清时，DMEM无血清培养基中的细胞密...

【专利技术属性】
技术研发人员：辛洪波，汪晓玉，管小卉，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：