一种nCoV-N蛋白检测试剂盒以及nCoV-N蛋白检测方法技术

本发明专利技术涉及免疫学检测技术领域，尤其涉及一种nCoV

【技术实现步骤摘要】
一种nCoV
‑
N蛋白检测试剂盒以及nCoV
‑
N蛋白检测方法


[0001]本专利技术涉及免疫学检测
，尤其涉及一种nCoV
‑
N蛋白检测试剂 盒以及nCoV
‑
N蛋白检测方法。

技术介绍

[0002]2019新型冠状病毒(2019
‑
nCoV)容易在人与人之间传播，不仅引发肺 炎，还损害免疫系统和其他器官。如今，2019
‑
nCoV已经成为国际关注的突 发公共卫生事件，冠状病毒快速准确检测是防疫的重中之重。在病毒的繁殖 中，核衣壳蛋白(Nucleocapsid Protein,N)，负责病毒基因组复制和调节细胞 信号通路，具有高度保守性，因此nCoV
‑
N蛋白常作为2019
‑
nCoV诊断检测 工具，是免疫学快速诊断试剂的核心原料。
[0003]对于当前中国所使用的两种检测试剂，2020年3月20日国务院联防联控 机制新闻发布会上介绍：当前批准上市的新冠肺炎检测试剂主要包括两类， 一类是核酸检测试剂，一类是抗体检测试剂。核酸检测过程包括标本处理、 核酸提取，进行PCR检测等多个步骤，平均检测时间需要2
‑
3个小时。该方 法敏感度高，特异性强但检测时间相对较长。抗体检测包括胶体金法和磁微 粒化学发光法，其中胶体金法平均检测时间15分钟左右，一滴血可在15分 钟内用肉眼能观察到检测结果，而磁微粒化学发光法一般需要30
‑
60分钟。 然而抗体检测是对人体血液中的抗体水平进行检测，若在病毒感染的早期， 人体内可能还没有产生抗体的，抗体检测存在检测的窗口期，只可以作为核 酸检测的辅助手段，开发准确快速的nCoV
‑
N蛋白检测试剂盒可以对病例进 行排查筛查。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术提供了一种nCoV
‑
N蛋白检测试剂盒以及nCoV
‑
N蛋白 检测方法，nCoV
‑
N蛋白检测试剂盒可以特异性识别nCoV
‑
N蛋白，直接指示 病毒感染，在5分钟即可获得测量结果，检测快捷灵敏。
[0005]其具体技术方案如下：
[0006]本专利技术提供了一种nCoV
‑
N蛋白检测试剂盒，包括：粘合板；
[0007]所述粘合板上依次设置有样品垫、结合垫、反应膜和吸收垫，所述反应 膜上设置有检测线和控制线；
[0008]所述结合垫上包被有金纳米粒子标记的第一nCoV
‑
N蛋白单克隆抗体溶 液，所述控制线上包被有第二nCoV
‑
N蛋白抗体溶液，所述控制线上包被有 羊抗鼠IgG溶液；
[0009]所述第一nCoV
‑
N蛋白单克隆抗体和所述第二nCoV
‑
N蛋白单克隆抗体结 合的所述nCoV
‑
N蛋白的表位不同。
[0010]本专利技术中，所述nCoV
‑
N蛋白的表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所 示，所述第二nCoV
‑
N蛋白单克隆抗体结合的所述nCoV
‑
N蛋白的表位氨基酸 序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]本专利技术中，反应膜优选为酸纤维素膜。
[0012]本专利技术中，所述样品垫包被有含0.5％Triton，1％BSA，2％蔗糖的50mM pH8.0的硼
酸
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硼砂缓冲液；
[0013]所述金纳米粒子标记的第一nCoV
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N蛋白单克隆抗体溶液的溶剂为含5％ BSA，0.25％Tween
‑
20和10％蔗糖的20mM Na3PO4；
[0014]所述金纳米粒子标记的第一nCoV
‑
N蛋白单克隆抗体溶液的浓度为 0.25
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0.5mg/mL，优选为0.5mg/mL；
[0015]所述第二nCoV
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N蛋白抗体溶液的浓度为0.5
‑
2.5mg/mL，优选为 1mg/mL；
[0016]所述羊抗鼠IgG溶液的浓度为0.5
‑
2.5mg/mL，优选为1mg/mL；
[0017]所述金纳米粒子标记的第一nCoV
‑
N蛋白单克隆抗体的用量为1
‑
5μ g/cm，优选为2μg/cm；
[0018]所述第二nCoV
‑
N蛋白抗体的用量为1～5μg/cm，优选为2μg/cm；
[0019]所述羊抗鼠IgG的用量为1～5μg/cm，优选为2μg/cm。
[0020]本专利技术中，金纳米粒子标记的第一nCoV
‑
N蛋白单克隆抗体溶液的制备 具体为：
[0021]a)取1mL0.01％HAuCl4溶液，加热并快速搅拌，沸腾后加入4mL 1％柠 檬酸三钠，继续加热搅拌至溶液变红后，将溶液再煮沸10min，在缓慢搅拌 下将其冷却至室温。通过离心4次(12
×
103rpm，20min)，浓缩并收集金纳 米粒子；
[0022]b)在10mL金纳米粒子水溶液中预先加入70μL0.1M K2CO3，再加入 1000μL(50μg)nCoV
‑
N蛋白抗体，室温条件下轻轻摇动30min，然后，加 入1mL1％牛血清蛋白，室温下封闭胶体金的未包被位点30min，接着将颗粒 离心(12
×
103rpm，20min)，并用buffer B漂洗三遍，以除去未结合的抗体， 得到铂纳米花标记的脱氢表雄酮多克隆抗体。
[0023]本专利技术中，所述第一nCoV
‑
N蛋白单克隆抗体的制备方法包括以下步 骤：
[0024]1)采用SEQ ID NO.1编码的蛋白的作为免疫原免疫小鼠，取血清效价高 的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，然后采用有限稀释法筛选 杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；
[0025]2)将单克隆杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，经辛酸
‑ꢀ
硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的第一nCoV
‑
N蛋白单克隆抗体。
[0026]本专利技术步骤1)中，采用SEQ ID NO.1编码的蛋白作为免疫原免疫小鼠具 体为：首次免疫使用等体积完全弗氏佐剂与SEQ ID NO.1编码的蛋白溶液进 行乳化，以后每次加强免疫使用等体积不完全弗氏佐剂与SEQ ID NO.1编码 的蛋白进行乳化，剂量同初次免疫，初次免疫后，每间隔14天加强免疫一 次，共加强3次；
[0027]所述初次免疫的剂量为100μg/只；
[0028]所述SEQ ID NO.1编码的蛋白溶液的浓度为100μg～500μg/mL，优选 为200μ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种nCoV
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N蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括：粘合板；所述粘合板上依次设置有样品垫、结合垫、反应膜和吸收垫，所述反应膜上设置有检测线和控制线；所述结合垫上包被有金纳米粒子标记的第一nCoV
‑
N蛋白单克隆抗体溶液，所述控制线上包被有第二nCoV
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N蛋白抗体溶液，所述控制线上包被有羊抗鼠IgG溶液；所述第一nCoV
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N蛋白单克隆抗体和所述第二nCoV
‑
N蛋白单克隆抗体结合的所述nCoV
‑
N蛋白的表位不同。2.根据权利要求1所述的nCoV
‑
N蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述nCoV
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N蛋白的表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二nCoV
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N蛋白单克隆抗体结合的所述nCoV
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N蛋白的表位氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求1所述的nCoV
‑
N蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述金纳米粒子标记的第一nCoV
‑
N蛋白单克隆抗体的用量为1
‑
5μg/cm；所述第二nCoV
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N蛋白抗体的用量为1～5μg/cm；所述羊抗鼠IgG的用量为1～5μg/cm。4.根据权利要求1所述的nCoV
‑
N蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述金纳米粒子标记的第一nCoV
‑
N蛋白单克隆抗体溶液的浓度为0.25
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0.5mg/mL；所述第二nCoV
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N蛋白抗体溶液的浓度为0.5
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2.5mg/mL；所述羊抗鼠IgG溶液的浓度为0.5
‑
2.5mg/mL。5.根据权利要求1所述的nCoV
‑
N蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述金纳米粒子标记的第一nCoV
‑
N蛋白单克隆抗体溶液的浓度为0.5mg/mL；所述第二nCoV
‑
N蛋白抗体溶液的浓度为1mg/mL；所述羊抗鼠IgG溶液的浓度为1mg/mL。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：方志远，卢宇靖，黃永樑，许泳瑜，佘梦婷，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：