膜结合核酸纳米孔制造技术

提供了一种跨膜纳米孔，所述纳米孔包含：a.提供支架组件的一个或多个多核苷酸链；和b.提供多个订书钉组件的多个多核苷酸链；其中所述多个订书钉组件中的每一个与所述支架组件杂交；其中包含在所述支架组件内的至少一个多核苷酸链的主要部分的取向基本上平行于膜的平面表面，并且嵌入在所述膜内并基本上与所述膜共面；其中所述纳米孔限定适合于穿透所述膜的通道；所述通道具有沿其中心延伸的纵向轴线和至少约3nm的垂直于所述纵向轴线的最小内部尺寸。还公开了一种包含所述纳米孔的膜、包含所述膜的生物传感器以及使用所述膜进行分子传感的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】膜结合核酸纳米孔
本专利技术属于基于核酸的纳米结构领域，所述基于核酸的纳米结构可以插入膜中并用作纳米孔。这类纳米孔可以用于化学和生物传感器、纳米级装置和分子门控应用的领域中。
技术介绍
纳米孔是可以限定穿孔并且从而在膜中形成通道的跨膜的聚合物和络合物，所述膜在两种流体(通常为液体，合适的水溶液)之间形成离子和某些分子可以通过的分隔。通道的最小直径通常在纳米(10-9米)范围内，因此将这些多肽中的某些称为‘纳米孔’。通道通常相对于膜的平面轴线以垂直取向形成，并且可以由蛋白质、肽、合成有机化合物或核酸(如DNA)形成(Howorka，《自然纳米技术(NatureNanotech.)，7月12日；619-630(2017))。结合在膜中的纳米孔具有许多潜在用途。一个实例是使用纳米孔作为传感器从而以无标签和便携方式分析生物分子。在这种方法的一个实施例中，跨越膜结合纳米孔施加电位，使离子流过通道。该离子流可以作为电流测量。例如，在WO2000/28312和D.Stoddart等人，《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)》，2010，106，7702-7中描述了使用单通道记录的合适的电测量技术。例如，在WO2009/077734和国际申请WO-2011/067559中也描述了多通道记录技术。光学测量可以与电测量组合(SoniGV等人，《科学仪器综述(RevSciInstrum.)》2010年1月；81(1)：014301)。替代地，可以通过提供跨膜离子梯度来实现离子通过膜结合纳米孔的流动。测量的电流可用于评估通道的大小或阻塞程度。电流的这些变化可用于识别分子或分子的一部分已经结合在孔处或孔附近(分子传感)，或者在某些系统中，其可用于基于其大小确定存在于孔内分子的身份(核酸测序)。已经针对几种基于蛋白质的纳米孔描述了核酸的链测序，如针对突变体MspA、Clya、α-溶血素以及CsgG(参见WO-2016/034591)。然而，基于蛋白质的纳米孔很难从头处理和设计。它们通常显示出具有狭窄管腔(小于5nm)的孔通道，这会限制其在各种生物传感应用中的效用。折叠的热力学可能很复杂，并导致无法插入并桥接膜的错误折叠的蛋白质。为了用作折叠蛋白质或其它大型生物分子的传感器，由纳米孔形成的合适的膜通道应满足某些标准，即：1)通道管腔应为至少约5nm宽，以容纳通道管腔内的大型生物分子；大型生物分子在通道内的结合导致比分析物在孔入口处结合时更高的读出灵敏度；2)应该在结构上限定孔以在电读出方面获得恒定的基准水平(即降低背景噪声)；和3)孔尺寸应可易于调节，以使其适应不同的生物分子大小。迄今为止，现有的生物或工程孔都没有满足所有这些标准。为了解决基于蛋白质的纳米孔的局限性，研究人员寻求使用基于核酸的体系。已经证明由核酸双链体，特别是DNA双链体构成的孔能够形成具有可调内部宽度的稳定纳米孔(BurnsJ.R.等人，《德国应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.)》52，12069-12072(2013)；和SeifertA.，K.，BurnsJ.R.，FertigN.，KeyserU.F.，HoworkaS.ACSNano9，1117-1126(2015))。DNA纳米孔的模块化构造原理已经实现了定制孔径(等人，《纳米快报(Nano.Lett.)》，15(5)，3134-3138(2015)；WO2013/083983)和安装可控闸门以调节转运(BumsJ.R.，SeifertA.，FertigN.，HoworkaS.A.，《自然纳米技术(Nat.Nanotechnol.)》11，152-156(2016))。跨膜核酸纳米孔通常由多个相互连接的DNA双链体的结构核心构成，所述DNA双链体封闭在两端开放的中空通道。DNA折纸技术可用于创建穿透并跨过脂质膜的茎，而桶形帽附着到膜的一侧并向外延伸以形成漏斗(Langecker等人，《科学(Science)》，11月16日；338(6109)：932-936(2012))。以这种方式，核酸纳米孔模拟了类似蛋白质纳米孔的构型。然而，与蛋白质和核酸纳米孔的这类构型相关的问题是，如分析物的分子可能与限定管腔内表面的壁或纳米孔的进入或离开孔口发生非特异性结合相互作用。这类非特异性结合可导致孔的通道阻塞，从而降低了包含这类孔的装置和传感器的效率、信号和工作寿命。由多个成束的双链体构成的核酸纳米孔的进一步考虑是它们可能易于穿过孔渗漏离子，从而导致测量电流的变化。这种变化是不希望的，并且会导致信号的准确性和保真度降低，同时背景噪声显著增加。不希望受理论的束缚，认为这些变化是由于核酸双链体束中结构完整性的丧失，所述双链体束受到平面膜力而导致束短暂分离或变得不对准，从而允许电流流过形成的间隙。本专利技术的一个目的是克服或至少改善现有技术中存在的问题。根据本文提供的教导，本专利技术的这些和其他用途、特征和优点对于本领域技术人员应该是显而易见的。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术提供了跨膜的纳米孔，所属纳米孔包含：a.提供支架组件的一个或多个多核苷酸链；和b.提供多个订书钉组件的多个多核苷酸链；其中多个订书钉组件中的每一个与支架组件杂交；其中包含在支架组件内的至少一个多核苷酸链的主要部分的取向基本上平行于膜的平面表面，并且嵌入在膜内并基本上与膜共面；其中纳米孔限定适合于穿透膜的通道；所述通道具有沿其中心延伸的纵向轴线和为至少约3nm的垂直于纵向轴线的最小内部尺寸。在本专利技术的具体实施例中，提供支架组件的一个或多个多核苷酸链以及多个订书钉组件中的至少一个中的任一个或两者进一步包含至少一个疏水锚，所述疏水锚促进纳米孔插入膜中。在另一个实施例中，通道具有垂直于纵向轴线的形状，所述形状选自由以下组成的组：环形；椭圆形；和多边形在本专利技术的第一方面的跨膜纳米孔的第一方面的具体实施例中，纳米孔包含：a.提供支架组件的一个或多个多核苷酸链，；和b.提供多个订书钉组件的多个多核苷酸链；其中多个订书钉组件中的每一个与支架组件杂交；其中包含在支架组件内的多核苷酸链的主要部分的取向基本上平行于膜的平面表面，并且嵌入在膜内并基本上与膜共面，使得纳米孔从而限定了穿透膜的通道，中央通道具有最小内部宽度为至少约3nm的管腔。在实施例中，本专利技术的跨膜纳米孔包含一个或多个模块。合适地，纳米孔进一步包含连接在一个或多个模块之间的子模块。在实施例中，所述模块或每个模块相同，使得纳米孔具有围绕通道的纵向轴线的旋转对称性。在另外的实施例中，所述模块或每个模块连接到至少一个其他模块。合适地，模块之间的连接由选自由以下组成的组的结构提供：模块之一的订书钉链或其一部分；模块之一的支架链或其一部分；子模块；提供间隔物组件的一个或多个多核苷酸链。在实施例中，跨膜纳米孔的支架组件包含至少第二多核苷酸链，任选地至少第二和第三或更多个支架多核苷酸链。合适地，包含在支架组件内的一个或多个多核苷本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种跨膜纳米孔，所述纳米孔包含：/na.提供支架组件的一个或多个多核苷酸链；和/nb.提供多个订书钉组件的多个多核苷酸链；/n其中所述多个订书钉组件中的每一个与所述支架组件杂交；/n其中包含在所述支架组件内的至少一个多核苷酸链的主要部分的取向基本上平行于膜的平面表面，并且嵌入在所述膜内并基本上与所述膜共面；/n其中所述纳米孔限定适合于穿透所述膜的通道；/n所述通道具有沿其中心延伸的纵向轴线和至少约3nm的垂直于所述纵向轴线的最小内部尺寸。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180802 GB 1812615.11.一种跨膜纳米孔，所述纳米孔包含：
a.提供支架组件的一个或多个多核苷酸链；和
b.提供多个订书钉组件的多个多核苷酸链；
其中所述多个订书钉组件中的每一个与所述支架组件杂交；
其中包含在所述支架组件内的至少一个多核苷酸链的主要部分的取向基本上平行于膜的平面表面，并且嵌入在所述膜内并基本上与所述膜共面；
其中所述纳米孔限定适合于穿透所述膜的通道；
所述通道具有沿其中心延伸的纵向轴线和至少约3nm的垂直于所述纵向轴线的最小内部尺寸。


2.根据权利要求1所述的跨膜纳米孔，其中提供支架组件的所述一个或多个多核苷酸链以及所述多个订书钉组件中的至少一个中的任一个或两者进一步包含至少一个疏水锚，所述疏水锚促进所述纳米孔插入所述膜中。


3.根据权利要求1或2所述的跨膜纳米孔，其中所述通道具有垂直于所述纵向轴线的形状，所述形状选自由以下组成的组：环形；椭圆形；和多边形。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的跨膜纳米孔，其中所述纳米孔包含一个或多个模块。


5.根据权利要求4所述的跨膜纳米孔，其中所述纳米孔进一步包含连接在所述一个或多个模块之间的至少一个子模块。


6.根据权利要求5所述的跨膜纳米孔，其中所述模块或每个模块相同，使得所述纳米孔具有围绕所述通道的所述纵向轴线的旋转对称性。


7.根据权利要求4至6中任一项所述的跨膜纳米孔，其中所述模块或每个模块连接到至少一个其他模块。


8.根据权利要求7所述的跨膜纳米孔，其中模块之间的所述连接由选自以下组成的组的结构提供：所述模块之一的订书钉链或其一部分；所述模块之一的支架链或其一部分；根据权利要求5所述的子模块；提供间隔物组件的一个或多个多核苷酸链。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的跨膜纳米孔，其中，当存在时，包含在所述支架组件、所述多个订书钉组件和/或所述间隔物组件内的至少一个多核苷酸链包含DNA。


10.根据权利要求1至9中任一项所述的跨膜纳米孔，其中所述纳米孔和/或其组件的组装是通过DNA折纸技术进行的。


11.根据权利要求1至10中任一项所述的跨膜纳米孔，其中所述至少一个疏水锚由包含在所述支架组件内的多核苷酸链的疏水部分构成。


12.根据权利要求1至11中任一项所述的跨膜纳米孔，其中所述至少一种疏水锚由所述多个订书钉组件中的至少一个或其疏水部分构成。


13.根据权利要求1至12中任一项所述的跨膜纳米孔，其中所述至少一个疏水部分包含多个疏水锚分子。


14.根据权利要求13所述的跨膜纳米孔，其中所述多个疏水锚分子：
a.附接到所述纳米孔的周边并基本上等距地围绕所述纳米孔的周边间隔开，并且其中所述多个疏水锚分子从所述纳米孔的所述通道的所述纵向轴线径向向外定向；和/或
b.附接到所述纳米孔或其一部分的面向膜侧，使得一旦插入，所述多个疏水锚分子定向为与所述膜相互作用和/或延伸到所述膜中。


15.根据权利要求12或13所述的跨膜纳米孔，其中所述纳米孔包含至少四个疏水锚分子。


16.根据权利要求1至10和权利要求13至14中任一项所述的跨膜纳米孔，其中所述至少一个疏水锚分子选自由以下组成的组：脂质；和卟啉。


17.根据权利要求15所述的跨膜纳米孔，其中所述脂质选自由以下组成的组：甾醇；烷基化酚；黄酮；饱和及不饱和脂肪酸；和合成脂质分子(包括十二烷基-β-D-葡糖苷)。


18.根据权利要求16所述的跨膜纳米孔，其中：
-所述甾醇选自由以下组成的组：胆固醇；胆固醇衍生物；植物甾醇；麦角甾醇；和胆汁酸；
-所述烷基化酚选自由以下组成的组：甲基化酚；长醇和生育酚；
-所述黄酮...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯特凡·霍华卡，邢永正，
申请(专利权)人：UCL商业有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB