癌症检测套组制造技术

本发明专利技术提供一种引物组及含有所述引物组或探针的套组，前述套组是用以供分析个体的MLH1的DNA序列、MLH1的mRNA序列、及/或cDNA序列(其是衍生自前述MLH1的mRNA)，以标定MLH1编码的蛋白质的V384突变。

【技术实现步骤摘要】
癌症检测套组本专利技术是申请日为2015年9月16日、申请号为201580050068.3(国际申请号：PCT/CN2015/089729)、专利技术名称为“癌症检测套组”的分案申请，通过引用将其全部内容结合到本专利技术。
本专利技术关于一种用于癌症检测的套组；更明确地，是关于一种具有引物组或探针以标定V384D突变的套组。
技术介绍
在人类的历史上，癌症很长一段时间被列为主要死亡原因。已有无数的研究聚焦于癌症的检测与治疗。可惜的是，绝大多数现今于临床上使用的癌症治疗方法仍不足以消除癌症的威胁。尽管如此，研究及临床上的经验已显示越早期治疗，越可提高癌症患者的存活率。这些证据支持了癌症检测的重要性，尤其是在癌变的早期阶段。一般来说，癌变的检测是藉由测定特定存在于癌症患者体内的生物标志(biomarker)。该些生物标记物可能是特定由癌细胞释出的物质、特定由癌细胞表达的细胞表面标志(cellsurfacemarker)、特定于癌细胞中沉默或过度表达的基因、或特定存在于癌细胞中的基因突变。在最近的报导中提到，DNA错配修复基因(hMLH1)的错义突变于多种癌症中可作为生物标志。hMLH1的V384D错义突变最早是在大肠直肠癌中被观察到，且经比对德国患者与华人患者，该错义突变是特定出现于华人患者(YapingWang,etal,1997)。后续的研究已证实前述发现，而由张等人于公元2004年进行的研究中更明确指出hMLH1的V384D错义突变发生于四种癌症，包括大肠直肠癌、胃癌、乳癌、及食道癌。另一个由XianzheShi等人于2003年的研究则显示V384D错义突变发生于肺癌。前述研究指出hMLH1的V384D错义突变有潜力成为癌症检测的候选标的。此外，本专利技术团队所做研究亦进一步证实hMLH1的V384D错义突变与肺癌的EGFR-TKIs疗法的抗药性相关(该实验数据记载于后续段落)。有鉴于此，经完善设计以供标定前述V384D突变的检测工具对于医药产业及临床上使用而言将有很大的帮助与价值。虽然目前已有部分研究揭露一些用于前揭目的的引物及探针，本专利技术的目标是提供专一性及敏感度更胜常规技术的引物组及/或探针。
技术实现思路
于是，本专利技术的一个目的为提供一种癌症检测套组，其使用可信赖的生物标志。本专利技术的另一个目的是提供一种套组，其用于评估EGFR-TKIs疗法的效果及/或个体经该疗法后的无恶化期存活率(progression-freesurvival)，从而可于进行EGFR-TKIs疗法后尽早规画后续的治疗。为了达到上述目的，本专利技术提供一种用于检测个体的MLH1基因编码蛋白质的V384突变的套组，其包含：第一引物，其包含SEQIDNO06所示序列；及第二引物，其包含SEQIDNO07所示序列；及/或第一引物，其包含SEQIDNO08所示序列；及第二引物，其包含SEQIDNO09所示序列。较佳地，前述套组进一步包含第三引物，其中前述第三引物包含SEQIDNO05所示序列。较佳地，权利要求1的前述套组，进一步包含DNA聚合酶。较佳地，前述套组进一步包含双链DNA结合染剂。较佳地，前述双链DNA结合染剂为GreenI、GreenII、Gold、OxazoleYellow、ThiazoleOrange、PicoGreen、，其组合。本专利技术又提供一种用于检测个体的MLH1基因编码蛋白质的V384突变的套组，其包含：第一引物，其包含SEQIDNO08所示序列；及第二引物，其包含SEQIDNO09所示序列。本专利技术另提供一种用于检测个体的MLH1基因编码蛋白质的V384突变的套组，其包含：至少一突变探针，其包含CAGATGGATC序列(SEQIDNO10)；其中该探针与一荧光体共轭；及/或至少一野生型探针，其包含CAGATGGTTC序列(SEQIDNO11)；其中该探针与一荧光体共轭。较佳地，前述至少一突变探针及/或前述至少一野生型探针系进一步与一淬灭体(quencher)共轭。较佳地，前述荧光体共轭于前述探针的5’端，且前述淬灭体共轭于前述探针的3’端。较佳地，前述至少一突变探针包含SEQIDNO17所示序列。较佳地，前述至少一野生型探针包含SEQIDNO16所示序列。较佳地，前述至少一突变探针及/或前述至少一野生型探针中的至少一个核苷酸是经修饰的以于其2’位置的氧原子及4’位置的碳原子之间形成桥接。较佳地，前述突变探针包含SEQIDNO19所示序列：5’-CACCAGATGGATCGTACA-3’。较佳地，前述突变探针自5’端数至3’端的第5、第8、第11、及第14个核苷酸是经修饰的以于其2’位置的氧原子及4’位置的碳原子之间形成桥接。较佳地，前述野生型探针包含SEQIDNO18所示序列：5’-CACCAGATGGTTCGTACA-3’。较佳地，前述野生型探针自5’端数至3’端的第5、第8、第11、及第14个核苷酸是经修饰的以于其2’位置的氧原子及4’位置的碳原子之间形成桥接。较佳地，前述套组进一步包含锚探针，其中该锚探针与一荧光体供体共轭。较佳地，前述至少一突变探针包含SEQIDNO21所示序列，且与一荧光体受体共轭。较佳地，前述至少一野生型探针包含SEQIDNO20所示序列，且与一荧光体受体共轭。较佳地，前述锚探针包含SEQIDNO22所示序列。较佳地，前述套组进一步包含引物组，其中前述引物组用于放大前述MLH1基因的至少一部分以取得复制体；其中前述复制体包含相应于前述V384突变的位置。较佳地，前述引物组为：顺向引物，其包含SEQIDNO12所示序列，及逆向引物，其包含SEQIDNO13所示序列；及/或顺向引物，其包含SEQIDNO14所示序列，及逆向引物，其包含SEQIDNO15所示序列。较佳地，前述套组进一步包含DNA聚合酶。总结来说，本专利技术提供一种新颖的引物组或探针，以供检测MLH1基因的V384突变。本专利技术亦提供包含该引物组或探针的套组。透过使用本专利技术的套组，对于V384突变的检测可以较常规技术更具专一性及敏感度。附图说明图1显示实施例一的即时同步聚合酶链式反应的实验结果(n＝2)；其中SEQIDNO07/SEQIDNO05引物组的实验结果标示为曲线(1)，SEQIDNO07/SEQIDNO06引物组的实验结果标示为曲线(2)，及阴性对照组的实验结果系标示为曲线(3)。(A)不具有V384D突变的个体的基因组DNA。(B)具有V384D突变的个体的基因组DNA(异型合子)。(C)人造质粒，其经建立有野生型MLH1基因的部分序列(同型合子)。(D)人造质粒，其经建立有带T1151A突变的MLH1基因的部分序列(同型合子)。图2显示实施例二的HRM试验法的实验结果(n＝2)。(A)标准阶段；(B)熔离曲线阶段。曲线1：人造质粒，其经建立有野生型MLH1基因的部分序列(同型合子)。曲线2：人造质粒，其经本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测个体的MLH1基因编码蛋白质的V384突变的套组，其包含：/n第一引物，其包含SEQ ID NO 06所示序列；及第二引物，其包含SEQ ID NO 07所示序列；或/n第一引物，其包含SEQ ID NO 08所示序列；及第二引物，其包含SEQ ID NO 09所示序列。/n

【技术特征摘要】
20140916 US 62/050,9631.一种用于检测个体的MLH1基因编码蛋白质的V384突变的套组，其包含：
第一引物，其包含SEQIDNO06所示序列；及第二引物，其包含SEQIDNO07所示序列；或
第一引物，其包含SEQIDNO08所示序列；及第二引物，其包含SEQIDNO09所示序列。


2.如权利要求1所述的套组，其进一步包含第三引物，其中前述第三引物包含SEQIDNO05所示序列。


3.如权利要求1所述的套组，其进一步包含DNA聚合酶。


4.如权利要求1所述的套组，其进一步包含双链DNA结合染剂。


5.如权利要求4所述的套组，其中前述双链DNA结合染剂为GreenI、GreenII、Gold、OxazoleYellow、ThiazoleOrange、PicoGreen或


6.一种用于检测个体的MLH1基因编码蛋白质的V384突变的套组，其包含：
至少一突变探针，其包含CAGATGGATC序列(SEQIDNO10)；其中该探针与一荧光体共轭；及/或
至少一野生型探针，其包含CAGATGGTTC序列(SEQIDNO11)；其中该探针与一荧光体共轭。


7.如权利要求6所述的套组，其中前述至少一突变探针及/或前述至少一野生型探针进一步与一淬灭体共轭；
优选地，其中前述荧光体共轭于前述探针的5’端，且前述淬灭体共轭于前述探针的3’端；
优选地，其中前述至少一突变探针包含SEQIDNO17所示序列；
优选地，其中前述至少一野生型探针包含SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈智豪，李孟儒，巫佳霖，刘育玮，
申请(专利权)人：得利富厦门生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35