一种多功能微环境保护外泌体水凝胶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种多功能微环境保护外泌体水凝胶及其制备方法与应用。其制备方法包括以下步骤：(1)获得脂肪来源的间充质干细胞，进行消化后获取原代细胞进行继代培养，取继代培养后的脂肪干细胞备用；(2)取脂肪来源的间充质干细胞，置于含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，采用超速离心法提取间充质干细胞释放的外泌体；(3)取巯基‑聚乙二醇溶解于脂肪干细胞外泌体中，然后将AgNO

【技术实现步骤摘要】
一种多功能微环境保护外泌体水凝胶及其制备方法和应用
本专利技术属于薄型子宫内膜修复
，具体涉及一种多功能微环境保护外泌体水凝胶及其制备方法和应用。
技术介绍
成功妊娠需要优质的胚胎、容受性良好的子宫内膜以及二者同步、协调的相互作用。子宫内膜的厚度对子宫内膜容受性有一定的影响，并影响胚胎的成功着床。由于雌激素水平低、感染、炎症、妊娠期宫腔操作史(如药流后清宫、人工流产、产后清宫)及宫腔粘连等，子宫内膜受到损伤、厚度变薄，降低了子宫内膜容受性，从而导致胚胎着床失败或妊娠后早期流产，严重影响女性的生育能力。薄型子宫内膜症状已导致长期不育和负面的家庭结局。关于薄型子宫内膜治疗的报道很多，但目前仍无一种特效方法。阿司匹林被认为可增加子宫及卵巢血流灌注，从而提高胚胎种植率及临床妊娠率而被广泛应用于临床，然而其疗效仍存在争议，近年来亦有研究发现阿司匹林并不能提高临床妊娠率、活产率、及减少流产率等，且患者孕期服用阿司匹林有引起出血等不良反应。近年来研究还发现枸橼酸西地那非片能降低子宫内膜血流阻力，使子宫内膜血管计数增加，从而改善子宫内膜血流灌注，促进子宫内膜生长，有利于胚胎着床，提高临床妊娠率，然而临床应用枸橼酸西地那非片可出现头痛、面色潮红、消化不良、鼻塞和视觉功能异常等不良反应，且尚无临床证据证明其是否对胎儿造成不利影响，而且使用枸橼酸西地那非片的患者仍有一部分疗效不满意。虽然目前的激素治疗能够改善一些妇女的生育效果，但由于复杂的子宫内膜微环境的损害和感染，这些反应仍然不令人满意。因此探索一种效果可靠、副作用小的改善薄型子宫内膜的治疗方法是近年临床应用中较为迫切的需求。已有研究表明，间充质干细胞具有强大增殖及多向分化能力、免疫调节、促进血管新生等潜能。由于骨髓源性干细胞(BMSCs)和脂肪源性干细胞(ADSCs)具有分化为子宫内膜上皮细胞和基质细胞的能力，已被研究作为再生子宫内膜的方法。干细胞疗法在再生医学和内膜修复领域有很大的应用前景，然而多项临床前瞻性研究发现干细胞移植远期临床效果欠佳。其中脂肪干细胞移植效率低下、存活率低等问题是制约临床干细胞移植应用的瓶颈。另外研究发现干细胞移植可能存在微血管栓塞、体内成瘤等安全问题亦限制其临床应用。目前干细胞治疗受到以下限制：对表型稳定细胞的持续来源的要求，对受管细胞的免疫介导排斥的风险，这些过程的高成本和技术困难，以及癌症或异位组织发育的潜在风险。近来脂肪干细胞分泌的膜性微囊泡外泌体引起了学者们的广泛关注和重视，成为干细胞研究领域的热点。脂肪干细胞外泌体可以模拟间充质干细胞生物学功能，发挥其促进血管新生、改善缺血组织的血流灌注、组织修复、免疫调节等作用。而且外泌体不具备细胞核结构，在宿主体内不能扩增，无异倍体性风险，脂肪干细胞外泌体能够穿过质膜，并且发生免疫排斥的可能性更小，在临床应用过程中具有较好的安全性，且不会像脂肪干细胞那样容易堵塞微血管，突破了脂肪干细胞治疗存在的较多问题，具有更广阔的临床应用前景。最近的研究表明，外泌体作为子宫内膜再生的介质具有明确的作用。干细胞来源的外泌体可以向近端或远端细胞传递蛋白质、mRNA、miRNAs和其他分子，从而有效地传播干细胞诱导的再生信号。虽然功能上类似于干细胞，但这些外泌体不太可能在接受治疗的宿主中诱导免疫反应，从而将排斥的风险降到最低。因此，基于外泌体的治疗方法有望成为推动子宫内膜再生的理想手段。然而，动物实验证实直接宫腔注射外泌体只能在宫腔停留数分钟到数小时，研究显示通过静脉注射途径少于5％的干细胞能到达损伤部位，大部分的干细胞在给药后的几个小时内凋亡，即使到达靶组织的干细胞中只有少量长期停留在损伤部位。由于子宫内膜再生是一个漫长的过程，需要持续的组织生长，因此设计一种新型的生物相容性支架，能够支持外泌体在子宫腔内的持续释放，从而延长其生物活性，加速子宫内膜再生，成为该领域研究的新方向。水凝胶是一种生物材料，通常用于组织修复应用，因为它们是生物相容性和可调的解决方案，可以模拟细胞外基质的结构，以提供更适合细胞增殖和再生的支架。水凝胶还可以在组织修复中介导药物的持续释放，使其成为一种很有前途的外泌体子宫内膜修复应用的候选药物。然而，一些因素限制了水凝胶在这个临床背景下的使用。其一，随着时间的推移，构成性组织活动可能导致水凝胶磨损。此外，将外泌体与水凝胶基质交联的不同方式(包括化学交联、醛交联、热交联、光交联)也会损害这些外泌体，从而降低其治疗效果。水凝胶注射也会增加局部细菌感染的风险，从而抑制组织再生。在上述背景下，如何设计一种新型多功能水凝胶，以实现一种利用温和的以协调为基础的外泌体交联方法，并表现出有益的自愈合、抗菌和载药性能，以期用于更好的修复治疗薄型子宫内膜，恢复生育能力和提高妊娠及出生率，成为亟待解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种多功能微环境保护外泌体水凝胶及其制备方法和应用。本专利技术提供的多功能微环境保护外泌体水凝胶，与已有报道的采用脂肪干细胞外泌体直接用于促进子宫内膜再生和恢复生育相比，以及与将脂肪干细胞水凝胶用于修复相比，表现出更佳的修复效果，其促进新生血管形成和子宫内膜组织再生的能力与现有技术相比更优，能够更好的帮助恢复生育能力，提高妊娠和出生率。本专利技术的目的之一是提供一种多功能微环境保护外泌体水凝胶的制备方法，其包括以下步骤：(1)从动物组织样本中分离获得脂肪来源的间充质干细胞，进行消化后获取原代细胞进行继代培养，取继代培养后的脂肪干细胞备用；(2)取脂肪来源的间充质干细胞，将其置于DMEM培养基中培养一段时间，然后采用超速离心法提取间充质干细胞释放的外泌体，将获得的外泌体稀释后进行使用；(3)取巯基-聚乙二醇溶解于步骤(2)的脂肪干细胞外泌体中得到混合物，所述巯基-聚乙二醇与脂肪干细胞外泌体的质量体积比为30mg：100μL，然后将AgNO3水溶液采用脂肪干细胞外泌体稀释后再加入到上述混合物中，数秒钟后形成透明的多功能微环境保护外泌体水凝胶。本专利技术的上述方法设计了一种多功能微环境保护外泌体水凝胶，通过采用原位显微注射促进子宫内膜再生和生育能力恢复。该外泌体水凝胶是通过制定Ag+—S之间的动态协调与脂肪干细胞外泌体的融合产生出一个注射制剂，并大幅度减少感染的风险，同时拥有脂肪干细胞的抗原和旁分泌信号活动的细胞，能够促使子宫内膜微环境的再生。在体外，该外泌体水凝胶具有显著的促新生血管作用，使人脐静脉内皮细胞增殖和血管形成，能够分别增加1.87倍和2.2倍。在体内，该微环境保护外泌体水凝胶也显示出促进新生血管和组织再生，同时抑制局部组织纤维化。重要的是，再生的子宫内膜组织更容易孕育胚胎并生出健康的新生儿。这种微环境保护的外泌体水凝胶系统为修复薄子宫内膜和恢复生育能力提供了一种方便、安全、无创的方法。进一步的是，步骤(2)中所述DMEM培养基中含10％胎牛血清和1％的链霉素/青霉素。进一步的是，步骤(2)中培养的条件为37℃下培养2周。进一步的是，步骤(2)中所述超速离心法的步骤为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多功能微环境保护外泌体水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)从动物组织样本中分离获得脂肪来源的间充质干细胞，进行消化后获取原代细胞进行继代培养，取继代培养后的脂肪干细胞备用；/n(2)取脂肪来源的间充质干细胞，将其置于DMEM培养基中培养一段时间，然后采用超速离心法提取间充质干细胞释放的外泌体，将获得的外泌体稀释后进行使用；/n(3)取巯基-聚乙二醇溶解于步骤(2)的脂肪干细胞外泌体中得到混合物，所述巯基-聚乙二醇与脂肪干细胞外泌体的质量体积比为30mg：100μL，然后将AgNO

【技术特征摘要】
1.一种多功能微环境保护外泌体水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从动物组织样本中分离获得脂肪来源的间充质干细胞，进行消化后获取原代细胞进行继代培养，取继代培养后的脂肪干细胞备用；
(2)取脂肪来源的间充质干细胞，将其置于DMEM培养基中培养一段时间，然后采用超速离心法提取间充质干细胞释放的外泌体，将获得的外泌体稀释后进行使用；
(3)取巯基-聚乙二醇溶解于步骤(2)的脂肪干细胞外泌体中得到混合物，所述巯基-聚乙二醇与脂肪干细胞外泌体的质量体积比为30mg：100μL，然后将AgNO3水溶液采用脂肪干细胞外泌体进行稀释后，再加入到上述混合物中，数秒钟后形成透明的多功能微环境保护外泌体水凝胶。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述DMEM培养基中含有10％的胎牛血清和1％的链霉素或青霉素。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中培养的条件为37℃下培养2周。


4.根据权利要求1所述的制备方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔文国，林嘉盈，王臻，俞小华，
申请(专利权)人：杭州贤石生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33