检测血液中甲基丙二酸含量的方法技术

本发明专利技术提供了检测血液中甲基丙二酸含量的方法，该方法包括：在一定检测条件下，利用高效液相串联质谱仪分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，各标准溶液中均含有浓度已知的甲基丙二酸标准品及内标物；根据各个标准溶液的色谱图拟合得到标准曲线方程；将内标工作液和血液样本混匀，加入乙腈并混匀，离心取上清液，通过加热氮吹的方式吹干上清液，吹干后加入含0‑2％甲酸和0‑20％乙腈的水溶液并混匀，离心取上清液得到待测样本；再同样检测待测样本得到其色谱图；根据待测样本的色谱图和标准曲线方程，计算血液样本中甲基丙二酸的含量。本方案提供了检测血液中甲基丙二酸含量的方法，样本前处理操作较简单，且成本较低。

【技术实现步骤摘要】
检测血液中甲基丙二酸含量的方法
本专利技术涉及临床化学
，特别涉及检测血液中甲基丙二酸含量的方法。
技术介绍
流行病学的调查数据显示，美国和加拿大调查人群中维生素B12缺乏率约20％，拉丁美洲国家可达40％，在印度儿童中甚至可高达80％。育龄期妇女、婴幼儿和老年人是维生素B12缺乏的高危人群。维生素B12缺乏可引起血液系统、代谢与神经系统病变，尤其增加了妊娠期妇女的生育风险，并影响婴幼儿的认知能力发育。有研究证实，有些血清维生素B12轻度降低的老年人，其血清中甲基丙二酸(Methylmalonicacid，MMA，分子式为C4H6O4)已明显增高，提示代谢物MMA的测定较血清维生素B12更为敏感，并且血清MMA的测定还可作为判断维生素B12补给量是否充足的标准。目前，可以采用液相色谱质谱联用法来检测血液中甲基丙二酸的含量，其中，血液样本的前处理方法可采用衍生化处理或使用超滤离心前处理。但是，衍生化处理操作较为繁琐，而超滤离心前处理其操作虽略为简单，但超滤离心管耗材价格昂贵，造成检测成本较高。
技术实现思路
本专利技术提供了检测血液中甲基丙二酸含量的方法，样本前处理操作较简单，且成本较低。为了达到上述目的，本专利技术是通过如下技术方案实现的：本专利技术提供了检测血液中甲基丙二酸含量的方法，包括：利用高效液相色谱串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的甲基丙二酸标准品及内标物，不同标准溶液中甲基丙二酸标准品的浓度不同；根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到甲基丙二酸的标准曲线方程；将一定量的内标工作液和一定量的血液样本混匀，再加入一定量的乙腈并混匀，离心取上清液，通过加热氮吹的方式吹干上清液，吹干后加入一定量的复溶液并混匀，离心取上清液得到待测样本，其中，内标工作液中含有浓度已知的内标物，复溶液为含0-2％甲酸和0-20％乙腈的水溶液；利用高效液相色谱串联质谱仪，在相同检测条件下检测待测样本，得到待测样本的色谱图；根据待测样本的色谱图和甲基丙二酸的标准曲线方程，计算血液样本中甲基丙二酸的含量。优选地，所述将一定量的内标工作液和一定量的血液样本混匀，再加入一定量的乙腈并混匀，离心取上清液，通过加热氮吹的方式吹干上清液，吹干后加入一定量的复溶液并混匀，离心取上清液得到待测样本，包括：用移液枪移取50-200μL血液样本于1.5mL离心管中，该血液样本为经处理至少1mL待检测血液而得到的血清或血浆，再加入一定量的内标工作液，在1000-2500rpm的转速下涡旋震荡混合20s-2min；再加入200-800μL乙腈，在1000-2500rpm的转速下涡旋震荡混合1-5min，再在10000-12000rpm的转速下高速离心5-12min，移取上清液200-950μL至另一1.5mL离心管中；在35-70℃下用氮气吹干上清液，然后加入50-200μL复溶液，在1000-2500rpm的转速下涡旋震荡混合1-3min，再在4-10℃的温度下及10000-14000rpm的转速下高速离心5-12min，取上清液得到待测样本。优选地，内标工作液中含0.5-20nmol/mL的甲基丙二酸-d3，添加量为10μL。优选地，所述检测条件中的液相条件包括：己基-苯基色谱柱，流动相A为含0.4％甲酸和2mM甲酸铵的水溶液，流动相B为乙腈，洗脱过程采用梯度洗脱的方式，分析时间为3-7min，柱温为20-45℃，进样量为3-20μL，流速为0.20-0.70mL/min。优选地，所述己基-苯基色谱柱包括：PhenomenexGeminiC6-Phenyl色谱柱，色谱柱的长度为150mm、内径为2.0mm、填料粒径为3μm。优选地，流速为0.40mL/min；所述洗脱过程包括：时间(min)流动相A(％)流动相B(％)0.009731.009731.505952.505952.519735.00973。优选地，所述检测条件中的串联质谱条件包括：ESI(-)检测模式，采集模式为MRM，气帘气压力为20-55psi，碰撞气压力为1-12psi，离子喷雾电压值为-1500至-4500V，离子化温度为200-750℃，雾化气压力为10-90psi，辅助气压力为10-90psi。优选地，气帘气压力为20psi，碰撞气压力为5psi，离子喷雾电压值为-2000V，离子化温度为550℃，雾化气压力为80psi，辅助气压力为60psi。优选地，在所述分别检测至少三个标准溶液之前，进一步包括：制备至少三个标准工作液，标准工作液中含有浓度已知的甲基丙二酸标准品，标准工作液中甲基丙二酸标准品的浓度在0.4-51.2nmol/mL范围内，不同标准工作液中甲基丙二酸标准品的浓度不同；利用移液器移取10μL标准工作液、10μL内标工作液置于离心管中，再移取加入所述复溶液80μL；将该离心管在转速为1000-2500rpm下涡旋混匀0.5-1min后，得到标准溶液。优选地，各个标准工作液中甲基丙二酸标准品的浓度分别为0.4nmol/mL、0.8nmol/mL、1.6nmol/mL、3.2nmol/mL、6.4nmol/mL、12.8nmol/mL、25.6nmol/mL、51.2nmol/mL。本专利技术提供了检测血液中甲基丙二酸含量的方法，该方法包括：在一定检测条件下，利用高效液相串联质谱仪分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，各标准溶液中均含有浓度已知的甲基丙二酸标准品及内标物；根据各个标准溶液的色谱图拟合得到标准曲线方程；将内标工作液和血液样本混匀，加入乙腈并混匀，离心取上清液，通过加热氮吹的方式吹干上清液，吹干后加入含0-2％甲酸和0-20％乙腈的水溶液并混匀，离心取上清液得到待测样本；再同样检测待测样本得到其色谱图；根据待测样本的色谱图和标准曲线方程，计算血液样本中甲基丙二酸的含量。本专利技术提供了检测血液中甲基丙二酸含量的方法，样本前处理操作较简单，且成本较低。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术一实施例提供的一种检测血液中甲基丙二酸含量的方法的流程图；图2是本专利技术一实施例提供的甲基丙二酸的化学结构式；图3是本专利技术一实施例提供的一标准溶液中甲基丙二酸标准品的色谱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测血液中甲基丙二酸含量的方法，其特征在于，包括：/n利用高效液相色谱串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的甲基丙二酸标准品及内标物，不同标准溶液中甲基丙二酸标准品的浓度不同；/n根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到甲基丙二酸的标准曲线方程；/n将一定量的内标工作液和一定量的血液样本混匀，再加入一定量的乙腈并混匀，离心取上清液，通过加热氮吹的方式吹干上清液，吹干后加入一定量的复溶液并混匀，离心取上清液得到待测样本，其中，内标工作液中含有浓度已知的内标物，复溶液为含0-2％甲酸和0-20％乙腈的水溶液；/n利用高效液相色谱串联质谱仪，在相同检测条件下检测待测样本，得到待测样本的色谱图；/n根据待测样本的色谱图和甲基丙二酸的标准曲线方程，计算血液样本中甲基丙二酸的含量。/n

【技术特征摘要】
1.检测血液中甲基丙二酸含量的方法，其特征在于，包括：
利用高效液相色谱串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的甲基丙二酸标准品及内标物，不同标准溶液中甲基丙二酸标准品的浓度不同；
根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到甲基丙二酸的标准曲线方程；
将一定量的内标工作液和一定量的血液样本混匀，再加入一定量的乙腈并混匀，离心取上清液，通过加热氮吹的方式吹干上清液，吹干后加入一定量的复溶液并混匀，离心取上清液得到待测样本，其中，内标工作液中含有浓度已知的内标物，复溶液为含0-2％甲酸和0-20％乙腈的水溶液；
利用高效液相色谱串联质谱仪，在相同检测条件下检测待测样本，得到待测样本的色谱图；
根据待测样本的色谱图和甲基丙二酸的标准曲线方程，计算血液样本中甲基丙二酸的含量。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述将一定量的内标工作液和一定量的血液样本混匀，再加入一定量的乙腈并混匀，离心取上清液，通过加热氮吹的方式吹干上清液，吹干后加入一定量的复溶液并混匀，离心取上清液得到待测样本，包括：
用移液枪移取50-200μL血液样本于1.5mL离心管中，该血液样本为经处理至少1mL待检测血液而得到的血清或血浆，再加入一定量的内标工作液，在1000-2500rpm的转速下涡旋震荡混合20s-2min；
再加入200-800μL乙腈，在1000-2500rpm的转速下涡旋震荡混合1-5min，再在10000-12000rpm的转速下高速离心5-12min，移取上清液200-950μL至另一1.5mL离心管中；
在35-70℃下用氮气吹干上清液，然后加入50-200μL复溶液，在1000-2500rpm的转速下涡旋震荡混合1-3min，再在4-10℃的温度下及10000-14000rpm的转速下高速离心5-12min，取上清液得到待测样本。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
内标工作液中含0.5-20nmol/mL的甲基丙二酸-d3，添加量为10μL。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述检测条件中的液相条件包括：己基-苯基色谱柱，流动相A为含0.4％甲酸和2mM甲酸铵的水溶液，流动相B为乙腈，洗脱过程采用梯度洗脱的方式，分析时间为3-7min，柱温为20-45℃，进样量为3-20μL，流速为0.20-0.70mL/min。


5.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱天祎，贾永娟，许丽，倪君君，
申请(专利权)人：北京和合医学诊断技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11