检测血液中维生素K2(MK-7)含量的方法技术

本发明专利技术提供了检测血液中维生素K2(MK‑7)含量的方法。一定检测条件下利用高效液相串联质谱仪分别检测至少三个标准溶液，得到各标准溶液的色谱图，各标准溶液中均含有浓度已知的维生素K2(MK‑7)标准品及内标物；根据各标准溶液的色谱图拟合得到标准曲线方程；将内标工作液和取自至少100μL血液的血液样本混匀，加入无水乙醇并混匀，再加入正己烷并混匀，离心取上清液，用氮气吹干上清液后加入含0‑0.1％甲酸和5‑20％水的乙腈溶液并混匀，离心取上清液得到待测样本；再同样检测待测样本得到其色谱图；根据该色谱图和标准曲线方程计算血液样本中维生素含量。样本前处理可不涉及到SPE过程，故可降低实验成本，且血液用量少。

【技术实现步骤摘要】
检测血液中维生素K2(MK-7)含量的方法
本专利技术涉及临床化学
，特别涉及检测血液中维生素K2(MK-7)含量的方法。
技术介绍
维生素K又叫凝血维生素，包括K1、K2、K3、K4等几种形式，其中K1、K2是天然存在的，属于脂溶性维生素。所有维生素K都是在结构上相似，但侧链越长吸收越好、生物活性越高、在血液中存在时间也越长。因此，长链的甲基萘醌类(特别是MK-7)是最优质的，因为它们能几乎完全被人体吸收，并停留在血液中的时间最长。已知最常见的成人VitK(VitaminK，维生素K)缺乏性出血，多发生于摄入含VitK低的膳食并服用抗生素的病人中，可见于吸收不良综合征和其它胃肠疾病，如囊性纤维化、口炎性腹泻、溃疡性结肠炎等。此外，胎盘转运VitK量少、新生儿初生时体内储存量低及体内肠道的无菌状态阻碍了VitK利用、母乳中VitK含量低、新生儿吸乳量少以及婴儿未成熟的肝脏还不能合成正常数量的凝血因子等原因，使新生儿、小婴儿普遍存在低凝血酶原症。但若服用超过药理剂量的VitK2，则会导致新生儿溶血性贫血、高胆红素血症和肝中毒，在成人则可诱发心脏病和肺病。维生素K2(MK-7)，或称Menaquinone-7、MK-7，分子式为C46H64O2，是维生素K2的一个类型。在最新研究中，《阿尔茨海默病杂志》和《科学报告》上发表的论文，分别考察了钙化导致的主动脉硬化对痴呆症和视网膜动脉健康的影响。研究发现，这两种疾病的发病条件都受到活性基质Gla蛋白(MGP)的影响，而当前最有效的血管钙化抑制剂即为维生素K2(MK-7)。此外，还有研究表明MK-7具有防治骨质疏松的作用。综上，对于血液中维生素K2(MK-7)的检测具有重要的临床意义。目前，可以采用液相色谱质谱联用法来检测血液中维生素K2(MK-7)的含量，但血液样本的前处理方法大多包括有SPE(Solid-PhaseExtraction，固相萃取)过程，使得实验成本有所提高，且检测所需血液用量较大。
技术实现思路
本专利技术提供了检测血液中维生素K2(MK-7)含量的方法，血液样本的前处理方法可以不涉及到SPE过程，故可降低实验成本，且减少了血液样本用量，可更好地应用于临床检验。为了达到上述目的，本专利技术是通过如下技术方案实现的：本专利技术提供了检测血液中维生素K2(MK-7)含量的方法，包括：利用高效液相色谱串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的维生素K2(MK-7)标准品及内标物，不同标准溶液中维生素K2(MK-7)标准品的浓度不同；根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到维生素K2(MK-7)的标准曲线方程；将一定量的内标工作液和一定量的血液样本混匀，然后加入一定量的无水乙醇并混匀，再加入一定量的正己烷并混匀，离心取上清液，通过氮吹的方式吹干上清液，吹干后加入一定量的稀释液并混匀，离心取上清液得到待测样本，其中，该血液样本为经处理至少100μL待检测血液而得到的血清或血浆，内标工作液中含有浓度已知的内标物，稀释液为含0-0.1％甲酸和5-20％水的乙腈溶液；利用高效液相色谱串联质谱仪，在相同检测条件下检测待测样本，得到待测样本的色谱图；根据待测样本的色谱图和维生素K2(MK-7)的标准曲线方程，计算血液样本中维生素K2(MK-7)的含量。优选地，所述将一定量的内标工作液和一定量的血液样本混匀，然后加入一定量的无水乙醇并混匀，再加入一定量的正己烷并混匀，离心取上清液，通过氮吹的方式吹干上清液，吹干后加入一定量的稀释液并混匀，离心取上清液得到待测样本，包括：用移液枪移取血液样本50-200μL于一离心管中，然后加入一定量的内标工作液，在1000-2500rpm的转速下涡旋震荡混合20s-2min；然后加入无水乙醇0.3-1.0mL，在1000-2500rpm的转速下涡旋震荡混合1-4min，再加入正己烷0.5-1.2mL，在1000-2500rpm的转速下涡旋震荡混合4-10min，再在10000-12000rpm的转速下高速离心5-12min，移取上清液至另一离心管中；用氮气吹干移取的上清液，吹干后加入50-400μL稀释液，在1000-2500rpm的转速下涡旋震荡混合1-3min，再在10000-14000rpm的转速下高速离心5-12min，取上清液得到待测样本。优选地，内标工作液中含10-60ng/mL的维生素K2(MK-7)-d7，添加量为10μL。优选地，所述检测条件中的液相条件包括：五氟苯基色谱柱，流动相A为含0.5％甲酸的水溶液，流动相B为甲醇与乙腈的混合溶液，该混合溶液中甲醇与乙腈的体积比为1:4，洗脱过程采用梯度洗脱的方式。优选地，所述五氟苯基色谱柱包括：PhenomenexKinetexF5色谱柱，色谱柱的长度为100mm、内径为2.1mm、填料粒径为1.7μm。优选地，流速为0.80mL/min；所述洗脱过程包括：时间(min)流动相A(％)流动相B(％)0.0012883.0012883.0101004.0001004.0112886.001288。优选地，分析时长为4-10min，柱温为30-50℃，进样量为5-50μL，流速为0.50-1.00mL/min。优选地，所述检测条件中的串联质谱条件包括：APCI(+)检测模式，采集模式为MRM，气帘气压力为20-55psi，碰撞气压力为1-12psi，雾化电流值为1-5μA，离子化温度为200-750℃，雾化气压力为10-90psi；辅助气压力为0psi。优选地，在所述分别检测至少三个标准溶液之前，进一步包括：制备至少三个标准工作液，标准工作液中含有浓度已知的维生素K2(MK-7)标准品，标准工作液中维生素K2(MK-7)标准品的浓度在0.3-153.6ng/mL范围内，不同标准工作液中维生素K2(MK-7)标准品的浓度不同；利用移液器移取10μL标准工作液、10μL内标工作液置于离心管中，再移取加入所述稀释液80μL；将该离心管在转速为1000-2500rpm下涡旋混匀0.5-1min后，得到标准溶液。优选地，各个标准工作液中维生素K2(MK-7)标准品的浓度分别为0.3ng/mL、0.6ng/mL、1.2ng/mL、2.4ng/mL、4.8ng/mL、9.6ng/mL、19.2ng/mL、38.4ng/mL、76.8ng/mL、153.6ng/mL。本专利技术提供了检测血液中维生素K2(MK-7)含量的方法。一定检测条件下利用高效液相串联质谱仪分别检测至少三本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测血液中维生素K2(MK-7)含量的方法，其特征在于，包括：/n利用高效液相色谱串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的维生素K2(MK-7)标准品及内标物，不同标准溶液中维生素K2(MK-7)标准品的浓度不同；/n根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到维生素K2(MK-7)的标准曲线方程；/n将一定量的内标工作液和一定量的血液样本混匀，然后加入一定量的无水乙醇并混匀，再加入一定量的正己烷并混匀，离心取上清液，通过氮吹的方式吹干上清液，吹干后加入一定量的稀释液并混匀，离心取上清液得到待测样本，其中，该血液样本为经处理至少100μL待检测血液而得到的血清或血浆，内标工作液中含有浓度已知的内标物，稀释液为含0-0.1％甲酸和5-20％水的乙腈溶液；/n利用高效液相色谱串联质谱仪，在相同检测条件下检测待测样本，得到待测样本的色谱图；/n根据待测样本的色谱图和维生素K2(MK-7)的标准曲线方程，计算血液样本中维生素K2(MK-7)的含量。/n

【技术特征摘要】
1.检测血液中维生素K2(MK-7)含量的方法，其特征在于，包括：
利用高效液相色谱串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的维生素K2(MK-7)标准品及内标物，不同标准溶液中维生素K2(MK-7)标准品的浓度不同；
根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到维生素K2(MK-7)的标准曲线方程；
将一定量的内标工作液和一定量的血液样本混匀，然后加入一定量的无水乙醇并混匀，再加入一定量的正己烷并混匀，离心取上清液，通过氮吹的方式吹干上清液，吹干后加入一定量的稀释液并混匀，离心取上清液得到待测样本，其中，该血液样本为经处理至少100μL待检测血液而得到的血清或血浆，内标工作液中含有浓度已知的内标物，稀释液为含0-0.1％甲酸和5-20％水的乙腈溶液；
利用高效液相色谱串联质谱仪，在相同检测条件下检测待测样本，得到待测样本的色谱图；
根据待测样本的色谱图和维生素K2(MK-7)的标准曲线方程，计算血液样本中维生素K2(MK-7)的含量。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述将一定量的内标工作液和一定量的血液样本混匀，然后加入一定量的无水乙醇并混匀，再加入一定量的正己烷并混匀，离心取上清液，通过氮吹的方式吹干上清液，吹干后加入一定量的稀释液并混匀，离心取上清液得到待测样本，包括：
用移液枪移取血液样本50-200μL于一离心管中，然后加入一定量的内标工作液，在1000-2500rpm的转速下涡旋震荡混合20s-2min；
然后加入无水乙醇0.3-1.0mL，在1000-2500rpm的转速下涡旋震荡混合1-4min，再加入正己烷0.5-1.2mL，在1000-2500rpm的转速下涡旋震荡混合4-10min，再在10000-12000rpm的转速下高速离心5-12min，移取上清液至另一离心管中；
用氮气吹干移取的上清液，吹干后加入50-400μL稀释液，在1000-2500rpm的转速下涡旋震荡混合1-3min，再在10000-14000rpm的转速下高速离心5-12min，取上清液得到待测样本。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
内标工作液中含10-60ng/mL的维生素K2(MK-7)-d7，添加量为10μL。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述检测条件中的液相条件包括：五氟苯基色谱柱，流动相A为含0.5％甲酸的水溶液，流动相B为甲醇与乙腈的混合溶液，该混合溶液中甲醇与乙腈的体积比为1:4...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱天祎，贾永娟，许丽，倪君君，
申请(专利权)人：北京和合医学诊断技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11