一种液质联用测定血浆中双氯芬酸浓度的方法技术

本发明专利技术公开了一种液质联用测定血浆中双氯芬酸浓度的方法，采用液质联用系统测定，先取待测样本，加入一定量的混合有机溶剂进行萃取，预处理后，经色谱柱分离，用质谱检测器检测。本发明专利技术方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为双氯芬酸的血药浓度测定提供依据；本方法的血浆标准曲线线性范围为2～3000ng/mL，批内和批间精密度RSD均小于±15％，适合于测定血浆中双氯芬酸的浓度。

【技术实现步骤摘要】
一种液质联用测定血浆中双氯芬酸浓度的方法
本专利技术属于医药
，具体涉及一种药物的测定方法，特别涉及一种液质联用测定血浆中双氯芬酸浓度的方法。
技术介绍
双氯芬酸是一种衍生于苯乙酸类的非甾体消炎镇痛药，其作用机制为抑制环氧化酶活性，从而阻断花生四烯酸转化前列腺素，因前列腺素为引起疼痛、发热以及炎症等现象的主要因子。同时，它也能促进花生四烯酸与甘油三酯(三酰甘油)结合，降低细胞内游离的花生四烯酸浓度，而间接抑制白三烯的合成。双氯芬酸是非甾体消炎药中作用较强的一种，它对前列腺素合成的抑制作用强于阿司匹林和吲哚美辛。目前，现有关于双氯芬酸测定方法的速度、精度、灵敏度、选择性均有待提高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种液质联用测定血浆中双氯芬酸浓度的方法，该方法可提高检测的灵敏度、精度、选择性和速度。为实现上述目的，本专利技术提供一种液质联用测定血浆中双氯芬酸浓度的方法，血浆样本经预处理后经高效液相色谱-串联质谱检测其浓度，具体方法包括以下步骤：(1)血浆样本预处理：血浆以K2EDTA为抗凝剂，以双氯芬酸-d4为内标；于96深孔板中精密加入100μL的血浆样本，加入5μL体积比为1：1的甲醇水溶液，混匀后加入5μL的8ng/μL的内标双氯芬酸-d4溶液，混匀后加入500μL的乙腈，涡旋混合1min，于20℃以3000rpm离心10min，取上层清液150μL上清液至另一装有350μL混合有机溶剂的96深孔板中，涡旋混匀10min，于20℃以3000rpm离心5min后作为测试样本待检测；其中：混合有机溶剂为乙腈：水：1M醋酸铵按照体积比5：95：0.1混合得到的混合溶液；(2)试样测定：取10μL测试样本注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样本中双氯芬酸和内标双氯芬酸-d4的色谱峰，并据此计算所述血浆样本中的双氯芬酸浓度；液相色谱测定条件为：色谱柱为AgilentZORBAXXDB-C18，柱规格为2.1×50mm；色谱柱温为40℃；流动相A为水：1M醋酸铵按照体积比为100：1混合得到的混合物；流动相B为乙腈：水：1M醋酸铵按照体积比为70：30：0.1混合得到的混合物；洗液为乙腈：水按照体积比为50：50混合得到的混合物；自动进样器温度为15℃；梯度洗脱，流速为0.4mL/min，进样量为10μL，分析时间3min；质谱测定条件为：离子源为电喷雾离子源，喷雾电压为-4500V，雾化温度为450℃，喷雾气压力为20Psi，辅助加热气压力为20Psi，气帘气压力为30Psi，碰撞气压力为Medium，双氯芬酸和内标双氯芬酸-d4的去簇电压均为-20eV；双氯芬酸和内标双氯芬酸-d4的碰撞室入口电压均为-8eV；双氯芬酸和内标双氯芬酸-d4的碰撞电压均为-20eV；双氯芬酸和内标双氯芬酸-d4的碰撞室出口电压均为-20eV；负离子方式检测；扫描方式为多重反应监测；用于定量分析的离子反应分别为：m/z293.8→m/z249.9，其为双氯芬酸；和m/z299.8→m/z256.0，其为双氯芬酸-d4。优选的，所述步骤(2)中梯度洗脱的程序为：总时间(min)流动相A(％)流动相B(％)0.0060.040.00.8060.040.00.9010.090.01.3010.090.01.4060.040.03.0060.040.0优选的，所述步骤(2)中，采用内标法，以双氯芬酸和内标双氯芬酸-d4的峰面积比值带入标准曲线方程计算所述血浆样本中的双氯芬酸的浓度。优选的，所述标准曲线方程的建立包括以下步骤：取十份50μL的空白血浆置于96深孔板中，并依次命名为最低定量下限样本、标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、最高定量上限样品、零浓度样品和空白样品共计十份样品，所述零浓度样品中含有内标双氯芬酸-d4溶液，不含双氯芬酸溶液，用于排除内标双氯芬酸-d4溶液对检测结果造成的干扰；所述空白样品中不含双氯芬酸溶液和内标双氯芬酸-d4溶液，用于排除所使用的空白血浆对检测结果造成的干扰；以贮备液的形式添加5μL浓度分别为0.04ng/μL、0.2ng/μL、1ng/μL、2ng/μL、10ng/μL、20ng/μL、40ng/μL、60ng/μL的双氯芬酸溶液至最低定量下限样本、标样1～6、最高定量上限样本中，分别向零浓度样本和空白样本加入5μL体积比为1：1的甲醇水溶液，将上述十份样品分别混匀，再分别向除空白样品外的九份样品中加入5μL的8ng/μL的内标双氯芬酸-d4溶液，向空白样本中加入5μL体积比为1：1的甲醇水溶液，再将上述十份样品分别混匀，再向十份样本中分别加入500μL的乙腈，涡旋混合1min，于20℃以3000rpm离心10分钟，取上层清液150μL上清液至另一装有350μL混合有机溶剂的96深孔板中，涡旋混匀10min，于20℃以3000rpm离心5min后作为十份标准样本待检测；其中：混合有机溶剂为乙腈：水：1M醋酸铵按照体积比5：95：0.1混合得到的混合溶液；分别取10μL标准样本注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样本中的双氯芬酸和内标双氯芬酸-d4的色谱峰，并据此得到标准曲线，以用于计算所述血浆中的双氯芬酸的浓度。进一步的，所述步骤(3)中的液相色谱测定条件还包括：自动进样器洗针体积为1000μL；自动进样器进样针深度为45mm；自动进样器清洗速度为35μL/s；自动进样器进样速度为5μL/s；自动进样器进样针清洗时浸泡时间为5s；自动进样器清洗模式为进样前及进样后。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：(1)预处理方法简便，两步有机溶液萃取，适用于常规测定；(2)专属性强：在本实验所采用的色谱条件下，双氯芬酸保留时间为0.955min左右，内标双氯芬酸-d4保留时间在0.937min左右，双氯芬酸和内标双氯芬酸-d4的峰形良好，无杂峰干扰测定，基线平稳；(3)灵敏度高：血浆最低定量限为2ng/mL，能准确测定血浆中双氯芬酸的浓度，灵敏度高，特异性强；(4)本专利技术方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为双氯芬酸的血药浓度测定提供依据。本方法的血浆标准曲线线性范围为2～3000ng/mL，批内和批间精密度RSD均小于±15％。附图说明图1为HPLC-MS/MS法测得的双氯芬酸在人血浆中的标准曲线图；图2为人空白血浆的HPLC-MS/MS图；图3为人空白血浆加入双氯芬酸-d4的HPLC-MS/MS图；图4为人空白血浆加入双氯芬酸和双氯芬酸-d4的HPLC-MS/MS图；图5为健康受试者口服双氯芬酸药物后血浆样本再加入内标双氯芬酸-d4的HPLC-MS/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种液质联用测定血浆中双氯芬酸浓度的方法，其特征在于：血浆样本经预处理后经高效液相色谱-串联质谱检测其浓度，具体方法包括以下步骤：/n(1)血浆样本预处理：/n血浆以K

【技术特征摘要】
1.一种液质联用测定血浆中双氯芬酸浓度的方法，其特征在于：血浆样本经预处理后经高效液相色谱-串联质谱检测其浓度，具体方法包括以下步骤：
(1)血浆样本预处理：
血浆以K2EDTA为抗凝剂，以双氯芬酸-d4为内标；于96深孔板中精密加入100μL的血浆样本，加入5μL体积比为1：1的甲醇水溶液，混匀后加入5μL的8ng/μL的内标双氯芬酸-d4溶液，混匀后加入500μL的乙腈，涡旋混合1min，于20℃以3000rpm离心10min，取上层清液150μL上清液至另一装有350μL混合有机溶剂的96深孔板中，涡旋混匀10min，于20℃以3000rpm离心5min后作为测试样本待检测；其中：混合有机溶剂为乙腈：水：1M醋酸铵按照体积比5：95：0.1混合得到的混合溶液；
(2)试样测定：
取10μL测试样本注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样本中双氯芬酸和内标双氯芬酸-d4的色谱峰，并据此计算所述血浆样本中的双氯芬酸浓度；
液相色谱测定条件为：色谱柱为AgilentZORBAXXDB-C18，柱规格为2.1×50mm；色谱柱温为40℃；流动相A为水：1M醋酸铵按照体积比为100：1混合得到的混合物；流动相B为乙腈：水：1M醋酸铵按照体积比为70：30：0.1混合得到的混合物；洗液为乙腈：水按照体积比为50：50混合得到的混合物；自动进样器温度为15℃；梯度洗脱，流速为0.4mL/min，进样量为10μL，分析时间3min；
质谱测定条件为：离子源为电喷雾离子源，喷雾电压为-4500V，雾化温度为450℃，喷雾气压力为20Psi，辅助加热气压力为20Psi，气帘气压力为30Psi，碰撞气压力为Medium，双氯芬酸和内标双氯芬酸-d4的去簇电压均为-20eV；双氯芬酸和内标双氯芬酸-d4的碰撞室入口电压均为-8eV；双氯芬酸和内标双氯芬酸-d4的碰撞电压均为-20eV；双氯芬酸和内标双氯芬酸-d4的碰撞室出口电压均为-20eV；负离子方式检测；扫描方式为多重反应监测；用于定量分析的离子反应分别为：m/z293.8→m/z249.9，其为双氯芬酸；和m/z299.8→m/z256.0，其为双氯芬酸-d4。


2.根据权利要求1所述的一种液质联用测定血浆中双氯芬酸浓度的方法，其特征在于：所述步骤(2)中梯度洗脱的程序为：





3.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：范志鸿，
申请(专利权)人：徐州立顺康达医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32