R N A干扰的目标碱基序列的搜索方法 ,导致 R N A干扰的多核苷酸的碱基序列的设计方法技术

一种搜索ＲＮＡ干扰的目标碱基序列的方法，其从ＲＮＡ干扰的目标基因碱基序列中搜索符合下述规则（ａ）－（ｄ）的序列部位：　　　　（ａ）３’末端的碱基是腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶，　　　　（ｂ）５’末端的碱基是鸟嘌呤或胞嘧啶，　　　　（ｃ）３’末端的７碱基序列中富含由腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶组成的群组中选择的１或１种以上的碱基，　　　　（ｄ）碱基数在能够产生ＲＮＡ干扰且不产生细胞毒性的范围内。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及RNA干扰(RNA interference)，具体地说，涉及提高应用RNA干扰的试验、制备等的效率及产生RNA干扰的多核苷酸序列的设计方法。在本说明书的以下部分中将RNA干扰记为“RNAi”。另外，本专利技术还涉及碱基序列处理装置、在计算机上执行碱基序列处理方法的程序、记录介质以及碱基序列处理系统，特别是涉及由RNA干扰的目标基因的碱基序列出发高效筛选能对目标基因产生RNA干扰的碱基序列的碱基序列处理装置、在计算机上执行碱基序列处理方法的程序、记录介质以及碱基序列处理系统。
技术介绍
RNA干扰是指一种由和意图阻断其功能的基因的特定区域相同的正义和反义RNA组成的双链RNA(double-stranded RNA)(以下简称为dsRNA)干扰、破坏目标基因的转录产物mRNA的相同部分的现象。1998年在线虫上被首次试验发现，可是，在哺乳动物上，当将30个或30个以上的长双链RNA向细胞内导入时就诱导干扰反应，细胞经细胞凋亡程序而死亡，采用RNA干扰存在困难。但另一方面也发现，在小鼠初期胚胎或哺乳动物培养细胞中也可以产生RNA干扰，RNA干扰的诱导机构本身在哺乳动物中也存在。现在，已经发现，短的、大约21-23碱基对的双链RNA(short interfering RNA，siRNA)能够在哺乳动物细胞系中不产生细胞毒性的同时诱导产生RNA干扰，从而使在哺乳动物中利用RNA干扰成为了可能。专利技术详述RNA干扰是一种值得期待有各种应用的技术，可是，在果蝇、线虫中发现，和某些基因的特定领域相同的双链RNA(dsRNA)以及小干扰RNA(siRNA)几乎所有的序列都可以显示干扰效果，但是在哺乳动物中随机选择的(21碱基的)小干扰RNA的70-80％都不显示RNA干扰效果。这对在哺乳动物中利用RNA干扰进行基因功能解析提出了很大的问题。而且，现有技术在设计小干扰RNA时，依赖试验者的经验、感觉的部分很多，很难高准确率地设计能够产生实际RNA干扰效果的小干扰RNA。另外，因为RNA合成需要时间、费用，所以，为进行RNA干扰而进行徒劳无益地合成小干扰RNA对于RNA干扰的研究以及众多的利用RNA干扰方法的普及都构成了妨碍。在以上这种情况下，提供一种简便、高效地进行RNA干扰的方法就成为了一个课题。为了解决上述课题，本专利技术者们针对RNA干扰法中最耗劳力、时间、费用的部分之一即如何容易地获得小干扰RNA的方法进行了研究。因为在哺乳动物中小干扰RNA的调节制备非常困难，本专利技术者们通过采用哺乳动物培养细胞系尝试确定能够有效地产生RNA干扰的序列的规律性，从而发现了有效产生RNA干扰的小干扰RNA的序列规律性，完成了本专利技术。本专利技术如下所示(1)搜索RNA干扰的目标碱基序列的方法，从RNA干扰的目标基因的碱基序列中搜索符合下述规则(a)-(d)的序列部位。(a)3’末端的碱基是腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶，(b)5’末端的碱基是鸟嘌呤或胞嘧啶，(c)3’末端的7碱基序列中富含由腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶组成的群组中选择的1或1种以上的碱基，(d)碱基数在能够产生RNA干扰且不产生细胞毒性的范围内。(2)上述(1)所述的目标碱基序列的搜索方法，其中在上述规则(c)中，7碱基中的至少3个或3个以上为从富含腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)组成的群组中选择的1或1种以上的碱基。(3)上述(1)或(2)中所述的目标碱基序列的搜索方法，其中在上述规则(d)中，碱基数为13-28。(4)在目标基因的碱基序列中搜索符合下述规则(a)-(d)的碱基序列、设计和搜索的碱基序列相同的碱基序列、从而产生RNA干扰的多核苷酸碱基序列设计方法。(a)3’末端的碱基是腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶，(b)5’末端的碱基是鸟嘌呤或胞嘧啶，(c)3’末端的7碱基序列中富含由腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶组成的群组中选择的1或1种以上的碱基，(d)碱基数在能够产生RNA干扰且不产生细胞毒性的范围内。(5)上述(4)所述的碱基序列设计方法，其中在上述规则(c)中，7碱基中的至少3个或3个以上为从富含腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)组成的群组中选择的1或1种以上的碱基。(6)上述(4)或(5)中所述的碱基序列设计方法，所设计的相同碱基序列的碱基数为13-28。(7)上述(4)至(6)任意一项所述的碱基序列设计方法，其中经过设计，使得上述所设计的相同碱基序列中至少80％或80％以上的碱基与搜索到的碱基序列一致。(8)上述(4)至(7)任意一项所述的碱基序列设计方法，其中搜索到的碱基序列的3’末端碱基和设计的碱基序列的3’末端碱基相同，而且，搜索到的碱基序列的5’末端碱基和设计的碱基序列的5’末端碱基相同。(9)上述(4)至(8)任意一项所述的碱基序列设计方法，在多核苷酸的3’末端添加突出部。(10)双链多核苷酸的制备方法，包括形成一条链，其在与规定序列相同的碱基序列的3’末端设一突出部，所述规定序列包含在目标基因的碱基序列中且符合下述规则(a)-(d)；形成另一条链，其在与上述规定序列相同的碱基序列的互补序列的3’末端设一突出部；合成双链多核苷酸时各链的碱基数设计成15-30，(a)3’末端的碱基是腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶，(b)5’末端的碱基是鸟嘌呤或胞嘧啶， (c)3’末端的7碱基序列中富含由腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶组成的群组中选择的1或1种以上的碱基，(d)碱基数在能够产生RNA干扰且不产生细胞毒性的范围内。(11)双链多核苷酸，通过以下方法合成从RNA干扰的目标基因的碱基序列中搜索符合下述规则(a)-(d)、碱基数为13-28的序列部位，形成两条链，其中一条链在与包含在目标基因的碱基序列中且符合下述规则(a)-(d)的规定序列相同的碱基序列的3’末端设一突出部，另一条链在与上述规定序列相同的碱基序列的互补序列的3’末端设一突出部，各链的碱基数设计成15-30。(a)3’末端的碱基是腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶，(b)5’末端的碱基是鸟嘌呤或胞嘧啶，(c)3’末端的7碱基序列中富含由腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶组成的群组中选择的1或1种以上的碱基，(d)碱基数在能够产生RNA干扰且不产生细胞毒性的范围内。(12)基因表达抑制方法，包含搜索步骤，是从RNA干扰的目标基因的碱基序列中搜索符合下述规则(a)-(d)、碱基数为13-28的序列部位，和双链多核苷酸合成步骤，所述双链中，一条链在与包含在目标基因的碱基序列中且符合下述规则(a)-(d)的规定序列相同的碱基序列的3’末端设一突出部，另一条链在与上述规定序列相同的碱基序列的互补序列的3’末端设一突出部，各链的碱基数设计成15-30，和抑制目的基因表达的步骤，其把合成的双链多核苷酸添加至希望抑制目标基因表达的表达系统中，(a)3’末端的碱基是腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶，(b)5’末端的碱基是鸟嘌呤或胞嘧啶，(c)3’末端的7碱基序列中富含由腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶组成的群组中选择的1或1种以上的碱基，(d)碱基数在能够产生RNA干扰且不产生细胞毒性的范围内。(13)碱基序列处理装置，其特征是，具备 部分碱基序列制作装置，其可取得RNA干扰的目标基因的碱基序列信息，并制作上述碱基序列信息中具有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种搜索RNA干扰的目标碱基序列的方法，其从RNA干扰的目标基因碱基序列中搜索符合下述规则(a)-(d)的序列部位(a)3’末端的碱基是腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶，(b)5’末端的碱基是鸟嘌呤或胞嘧啶，(c)3’末端的7碱基序列中富含由腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶组成的群组中选择的1或1种以上的碱基，(d)碱基数在能够产生RNA干扰且不产生细胞毒性的范围内。2.权利要求1记载的搜索目标碱基序列的方法，其中在上述规则(c)中，7碱基中的至少3个或3个以上为从腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶组成的群组中选择的1或1种以上的碱基。3.权利要求1或2记载的搜索目标碱基序列的方法，其中在上述规则(d)中，碱基数为13-28。4.设计用于产生RNA干扰的多核苷酸碱基序列方法，其包括，在目标基因的碱基序列中搜索符合下述规则(a)-(d)的碱基序列，并设计与搜索到的碱基序列相同的碱基序列(a)3’末端的碱基是腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶，(b)5’末端的碱基是鸟嘌呤或胞嘧啶，(c)3’末端的7碱基序列中富含由腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶组成的群组中选择的1或1种以上的碱基，(d)碱基数在能够产生RNA干扰且不产生细胞毒性的范围内。5.权利要求4记载的碱基序列设计方法，其中在上述规则(c)中，7碱基中的至少3个或3个以上为从腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶组成的群组中选择的1或1种以上的碱基。6.权利要求4或5记载的碱基序列设计方法，其中所设计的相同碱基序列的碱基数为13-28。7.权利要求4至6任意一项记载的碱基序列设计方法，其中经过设计，使得上述所设计的相同碱基序列中至少80％或80％以上的碱基与搜索到的碱基序列一致。8.权利要求4至7任意一项记载的碱基序列设计方法，其中搜索到的碱基序列的3’末端碱基和设计的碱基序列的3’末端碱基相同，而且，搜索到的碱基序列的5’末端碱基和设计的碱基序列的5’末端碱基相同。9.权利要求4至8任意一项记载的碱基序列设计方法，其中在多核苷酸的3’末端添加突出部。10.双链多核苷酸的制作方法，包括形成一条链，其在与规定序列相同的碱基序列的3’末端设一突出部，所述规定序列包含在目标基因的碱基序列中且符合下述规则(a)-(d)；形成另一条链，其在与上述规定序列相同的碱基序列的互补序列的3’末端设一突出部；合成双链多核苷酸时各链的碱基数设计成15-30，(a)3’末端的碱基是腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶，(b)5’末端的碱基是鸟嘌呤或胞嘧啶，(c)3’末端的7碱基序列中富含由腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶组成的群组中选择的1或1种以上的碱基，(d)碱基数在能够产生RNA干扰且不产生细胞毒性的范围内。11.双链多核苷酸，通过以下方法合成从RNA干扰的目标基因的碱基序列中搜索符合下述规则(a)-(d)、碱基数为13-28的序列部位，形成两条链，其中一条链在与包含在目标基因碱基序列中且符合下述规则(a)-(d)的规定序列相同的碱基序列的3’末端设一突出部，另一条链在与上述规定序列相同的碱基序列的互补序列的3’末端设一突出部，且各链的碱基数设计成15-30，(a)3’末端的碱基是腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶，(b)5’末端的碱基是鸟嘌呤或胞嘧啶，(c)3’末端的7碱基序列中富含由腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶组成的群组中选择的1或1种以上的碱基，(d)碱基数在能够产生RNA干扰且不产生细胞毒性的范围内。12.基因表达抑制方法，包含搜索步骤，是从RNA干扰的目标基因的碱基序列中搜索符合下述规则(a)-(d)、碱基数为13-28的序列部位，和合成双链多核苷酸的步骤，所述双链中，一条链在与包含在目标基因碱基序列中且符合下述规则(a)-(d)的规定序列相同的碱基序列的3’末端设一突出部，另一条链在与上述规定序列相同的碱基序列的互补序列的3’末端设一突出部，各链的碱基数设计成15-30，和抑制目的基因表达的步骤，其把合成的双链多核苷酸添加至想要抑制目标基因表达的表达系统中(a)3’末端的碱基是腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶，(b)5’末端的碱基是鸟嘌呤或胞嘧啶，(c)3’末端的7碱基序列中富含由腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶组成的群组中选择的1或1种以上的碱基，(d)碱基数在能够产生RNA干扰且不产生细胞毒性的范围内。13.碱基序列处理装置，其特征是，具备部分碱基序列制作装置，其可取得RNA干扰的目标基因的碱基序列信息，并制作上述碱基序列信息中具有预定碱基数的序列部位的部分碱基序列信息形成部分碱基序列，和3’末端碱基判定装置，其判定由上述部分碱基序列制作装置制作的部分碱基序列信息的3’末端的碱基是否是腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶，和5’末端碱基判定装置，其判定由上述部分碱基序列制作装置制作的部分碱基序列信息的5’末端的碱基是否是鸟嘌呤或胞嘧啶，和判定是否包含预定碱基的装置，其判定包含上述部分碱基序列制作装置制作的部分碱基序列信息3’末端7碱基的碱基序列信息是否富含由腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶组成的群组中选择的1或1种以上的碱基预定碱基，和规定序列选择装置，根据上述3’末端碱基判定装置、上述5’末端碱基判定装置、上述判定是否包含预定碱基的...

【专利技术属性】
技术研发人员：西乡薰，程久美子，内藤雄树，
申请(专利权)人：生物智囊团株式会社，
类型：发明
国别省市：