一株高效表达几丁质酶重组菌的构建及高酶活突变体的筛选制造技术

一株高效表达几丁质酶重组菌的构建及高酶活突变体的筛选。本发明专利技术借助重组蛋白技术实现BcchiA1在枯草芽孢杆菌中的高效分泌型表达，解决了大部分微生物几丁质酶分泌量不足的问题。同时，创建一种新的几丁质酶高通量筛选方法，极大地提高了筛选通量和效率。此外，本发明专利技术涉及公开几株高酶活几丁质酶突变体，BcchiA1(Y10A)、BcchiA1(R301A)、BcchiA1(E327A)、BcchiA1(Y10A/R301A)、BcchiA1(Y10A/E327A)、BcchiA1(R301A/E327A)和BcchiA1(Y10A/R301A/E327A)，酶活性比野生型BcchiA1分别提高了2.49倍、0.67倍、3.61倍、2.39倍、3.46倍、4.75倍、16.89倍，其中BcchiA1(Y10A/R301A/E327A)酶活性最优。最终，将几丁质酶BcchiA1及其最优突变体BcchiA1(Y10A/R301A/E327A)与来源于Bacillus atrophaeus的单加氧酶BatLPMO10分别协同作用后，可使BcchiA1和BcchiA1(Y10A/R301A/E327A)的水解效率分别提高50.00％和46.71％。

【技术实现步骤摘要】
一株高效表达几丁质酶重组菌的构建及高酶活突变体的筛选
本专利技术涉及一株高效分泌表达环状芽孢杆菌几丁质酶重组菌的构建以及几丁质酶突变体的高通量筛选，属基因工程

技术介绍
几丁质是由N-乙酰-D-葡糖胺(NAG)通过β-1,4糖苷键连接的线性高聚物，是自然界中分布最广泛的氨基多糖，尤其作为节肢动物外骨骼以及真菌细胞壁的结构组分。几丁质具有良好的生物相容性、广谱抗菌性、无毒副作用等特性，故在生物医疗、食品、环保以及化妆品行业应用前景广阔。然而，几丁质的高结晶度和溶性差的特性对于进一步提升应用价值无疑是一个严峻挑战。几丁寡糖，聚合度低于20，是几丁质的主要降解产物之一。因溶解度较几丁质大幅改善，因此在免疫调节、抗菌、抗肿瘤、细胞修复等方面表现突出。目前，几丁寡糖主要通过化学、物理和生物酶法三种途径降解几丁质获得。其中，生物酶法因环境友好、反应条件温和、降解过程易控、副产物少等优点备受青睐，该方法主要依靠几丁质酶完成。几丁质酶在农业和环境方面具有不可估量的应用价值，如几丁质废物的生物处理、几丁寡糖的制备、用作生物防治剂以及用于菌株改良的真菌和酵母中分离原生质体等。几丁质酶广泛分布于真核生物、原核生物、古细菌和病毒中，主要催化β-1,4糖苷键的随机断裂生成聚合度低、水溶性良好的几丁寡糖。但是由于几丁质的高结晶度，使得几丁质酶与底物无法充分接触，导致生物酶法效率低下。因此，我们致力于找寻几丁质酶活性优异的菌株。其中，环状芽孢杆菌几丁质酶BcchiA1，对于不溶性的几丁质具有很高的亲和力和水解活性，应用价值巨大。目前，许多微生物能够分泌一定量的几丁质酶，但是普遍存在分泌量不足的问题。重组蛋白技术是直接获取大量且高纯度几丁质酶的重要技术手段。与其他外源基因表达系统相比，微生物表达系统因生长快、培养周期短、成本低廉等特点在蛋白表达技术中应用广泛，常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母表达系统等。大肠杆菌作为研究最为透彻且发展迅速的原核表达系统，存在多数目的蛋白为非分泌型表达、胞内大量聚集易形成包涵体、胞内杂蛋白多等弊端，导致后续的分离纯化步骤繁琐且耗时。酵母表达系统作为应用较为广泛的一类真核表达系统，如酿酒酵母、毕赤酵母等，尤其适于表达低等真核生物来源的目的蛋白，但酿酒酵母因缺乏转录强度高的启动子而不适于外源蛋白的高水平表达，而毕赤酵母的诱导物甲醇易致毒害，也使得该系统存在较为明显的缺陷。枯草芽孢杆菌无致病性，不含外毒素和内毒素，是广泛应用于医药和食品加工业的安全菌种(GRAS)，尤其在生产和分泌酶等活性蛋白质方面潜力巨大，后续分离纯化步骤简洁、高效。此外，该宿主具有遗传背景清晰、分子操作简单、发酵周期短等特点，在应用微生物领域优势显著。为了解决上述提及到的关于野生型几丁质酶分泌量不足以及活性低的问题，本专利技术将在增加环状芽孢杆菌几丁质酶BcchiA1分泌量的基础上，进一步提高酶活性，以期更好地满足应用需求。
技术实现思路
本专利技术首先构建了一株高效分泌环状芽孢杆菌几丁质酶的枯草芽孢杆菌重组菌，并开发出一种高效、简洁的高通量筛选方法对突变库进行筛选，进而获得高酶活突变体。此外，将单加氧酶与几丁质酶协同处理几丁质类底物，旨在进一步提高几丁质酶的酶解效率。本专利技术第一方面涉及公开一种编码来自于BacilluscirculansWL-12的几丁质酶BcchiA1基因，其特征在于根据密码子偏好性优化后的核酸序列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术第二方面涉及公开一种重组表达质粒pMATE-BcchiA1，其特征在于，该重组表达质粒是携带RepB复制子的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌穿梭型质粒，含有权利要求1所述的核酸序列，且无信号肽。本专利技术第三方面涉及公开三种几丁质酶单点突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列在SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的10位Tyr突变为Ala，或第301位Arg突变为Ala，或第327位Glu突变为Ala，酶比活力比BcchiA1野生型分别提高了2.49倍、0.67倍、3.61倍。本专利技术第四方面涉及公开四种基于单点突变叠加的几丁质酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列在SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的10位Tyr突变为Ala和第301位Arg突变为Ala，或10位Tyr突变为Ala和第327位Glu突变为Ala，或301位Arg突变为Ala和327位Glu突变为Ala,或10位Tyr突变为Ala、301位Arg突变为Ala和327位Glu突变为Ala，酶比活力较BcchiA1野生型分别提高了2.39倍、3.46倍、4.75倍、16.89倍。本专利技术第五方面涉及公开一系列基因工程菌Bacillussubtilis1A751，其特征在于，含有本专利技术第一至第四方面涉及到的任一项所述的重组表达质粒，该重组菌在没有信号肽的作用下，成功实现BcchiA1的高效分泌型表达。本专利技术第六方面涉及公开一种新型几丁质酶定向进化方法，它包括构建突变库和高通量筛选两部分。突变库的建立主要利用易错PCR完成；高通量筛选所用的底物为染色剂雷玛唑亮蓝(RBB)与胶体几丁质(CC)形成的复合物CC-RBB，该复合物能够在几丁质酶的作用下将底物降解，释放出游离的RBB，进而测定吸光值。本方法中测定的吸光值范围为OD575-OD610，CC-RBB的浓度范围为2％-40％。其中，最优选择为OD595和2％底物浓度。本专利技术第七方面涉及公开上述几丁质酶以及一系列突变体、编码基因、表达载体、重组菌在降解几丁质类物质中的应用。其中，几丁质酶BcchiA1及其突变体BcchiA1(Y10A/R301A/E327A)与来源于Bacillusatrophaeus的单加氧酶BatLPMO10分别协同作用后，可使BcchiA1和BcchiA1(Y10A/R301A/E327A)的水解效率分别提高50.00％和46.71％。本专利技术的有益效果是首先利用蛋白重组技术，在没有信号肽的情况下实现环状芽孢杆菌几丁质酶在枯草芽孢杆菌中的高效分泌型表达。通常绝大多数异源蛋白的表达都需要找到与之匹配的信号肽，从而实现目的蛋白在表达宿主中的大量分泌，但至今无法找到一个能够和所有目的蛋白相匹配的信号肽，即缺乏普适性。但本专利技术无需借助任何信号肽即可将几丁质酶BcchiA1大量分泌至胞外，节省了筛选信号肽这一繁重任务。其次，开发出一种高效、经济、便捷的几丁质酶高通量筛选方法，使筛选的通量和效率大幅提升，为以后几丁质酶的高通量筛选提供了良好的技术参考。再者，筛选出一系列高酶活的几丁质酶突变体，最优者BcchiA1(Y10A/R301A/E327A)酶活性较野生型提高了16.89倍，具有十分可观的工业应用价值。最后，借助于BatLPMO10对BcchiA1及其突变体BcchiA1(Y10A/R301A/E327A)的协同作用，进一步增强几丁质酶的水解效率。附图说明图1是几丁质酶BcchiA1及其突变体在枯草芽孢杆菌中分泌表达的SDS-PAGE结果图。M本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种编码环状芽孢杆菌的几丁质酶，其特征在于，根据密码子偏好性优化后的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种编码环状芽孢杆菌的几丁质酶，其特征在于，根据密码子偏好性优化后的核酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述的几丁质酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.几丁质酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列在SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的10位Tyr突变为Ala，或第301位Arg突变为Ala，或第327位Glu突变为Ala；
在另一优选例中，所述突变体的氨基酸序列在SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的10位Tyr突变为Ala和第301位Arg突变为Ala，或10位Tyr突变为Ala和第327位Glu突变为Ala，或第301位Arg突变为Ala和第327位Glu突变为Ala；
在另一优选例中，所述突变体的氨基酸序列在SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的10位Tyr突变为Ala，第301位Arg突变为Ala和第327位Glu突变为Ala。


4.根据权利要求3所述的几丁质酶突变体，其特征在于，所述突变体的核酸序列在SEQIDNo.1所示的核酸序列的第28-30位的tat突变为gca，或第901-903位aga突变为gca，或第979-981位gag突变为gca；
在另一优选例中，所述突变体的核酸序列在SEQIDNo.1所示的核酸序列的第28-30位的tat突变为gca和第901-903位aga突变为gca，或第28-30位的tat突变为gca和第979-981位gag突变为gca，或第901-903位aga突变为gca和第979-981位gag突变为gca；
在另一优选例中，所述突变体的核酸序列在SEQIDNo.1所示的核酸序列的第28-30位的tat突变为gca，第901-903位aga突变为gca和第979-981位gag突变为gca。


5.一种重组表达质粒，其特征在于，该质粒含有权利要求1-4任一项所述的核酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大伟，王思佳，付刚，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12