膜蛋白分子相互作用的光学探测方法技术

一种膜蛋白分子之间相互作用的光学探测方法，其特征在于该方法包括下列步骤：采用全内反射荧光成像系统探测细胞膜，在细胞膜的不同区域获取多组目标膜蛋白分子的图像，每组图像对应细胞膜的一个区域，每组图像包含多幅膜蛋白分子的序列图片；利用计算机进行数据处理，绘制荧光强度与时间的关系曲线图，采用荧光强度与时间的关系曲线的淬灭次数判断图像中所含聚合的膜蛋白的分子数目；采用中心定位法确定聚合的膜蛋白中每个分子的位置，由此确定膜蛋白的分子之间的间距；重复第二步和第三步对每组图像逐一进行数据处理，绘制淬灭步骤统计图和分子间距统计图，以获得膜蛋白的聚合程度和分子间距的统计结果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物学蛋白质，特别是一种膜蛋白分子之间相互作用的光学探测方法。
技术介绍
蛋白质是细胞功能的主要执行者，细胞功能的实现实质上是细胞内或细胞间各种蛋白质分子相互作用的结果，因此研究蛋白质之间的相互作用是理解细胞生命活动过程中化学机械运转的关键，是生物学领域中的重大课题。尤其是在人类基因组测序工作完成之后，生命科学进入了后基因组学时代，在分子水平上研究蛋白质和蛋白质之间相互作用，揭示生物在体状态下的生命活动过程成为生命科学、信息科学共同面临的机遇和挑战。但是迄今为止，研究蛋白质分子之间相互作用的手段是很有限的。已知的生物化学技术，如免疫共沉淀(Robin.L，J.Virology，Vol.71，9803～9807，1997)、化学交联(Jean.D.G，PNAS，Vol.86，4007～4011，1989)、片段层析(Pedro.C，PNAS，Vol.61，636～643，1968)等方法结合基因操作产生蛋白质突变以及蛋白质晶体结构的分析，筛选了许多重要蛋白质的相互作用并对其结构基础有所了解，给我们带来了丰富的信息。然而，这些生化信息都是离体(in vitro)研究的结果，并不能反应生理状况下的情况，无法回答在活细胞内蛋白质分子之间相互作用的动力学问题。酵母双杂交技术是目前广泛采用的在体(in vivo)条件下研究蛋白质相互作用的方法，它能快速检测蛋白质相互作用，包括相应的结构域和基因编码(Fields S，Nature，Vol.340，245～246，1989；Chien C.T，PNAS，Vol.88，9578～9582，1991；Bai C，Methods Enzymol，Vol.283，141～156，1996)。但是该方法也有固有的缺陷①它只是个筛选系统，并不能直接将蛋白质相互作用与特定的细胞功能联系起来；②而且它只能检测细胞核内的蛋白质相互作用，对研究膜蛋白的相互作用则很困难；③在某些情况下会导致假阳性的错误信息(Rossi F，PNAS，Vol.94，8405～8410，1997)。光学显微成像方法可以实现蛋白质相互作用的在体探测，但是单一的成像的空间分辨率受衍射极限的限制，无法突破200nm，无法在更深入的层次上诠释生命活动的细节信息(Georgiou G.N，FEBS.Lett，Vol.250，487-492，1989)。近场光学成像方法虽然可以实现nm级的空间分辨率，但是由于其固有探测原理的限制，很难实现在体探测(沈玉民、朱星，物理，Vol.29，13，2000)。上世纪90年代发展起来的荧光共振能量转移技术(以下简称FRET)，以不同于传统手段的全新原理大大促进了生物分子之间相互作用的研究，它的出现使我们对1～10nm范围内的相互作用探测成为可能，并且可以用于在体环境(Truong K，Curr.Opin.Struct.Biol，Vol.11，573～578，2001；Sorkin.A，Curr.Biol，Vol.10，1395～1398，2000)。但是FRET方法依然面临着很多问题，例如它需要合适的供体-受体分子对(Pollok B A，Trends.Cell.Biol，Vol.9，57～60，1999；Sekar R B，J.Cell.Biol，Vol.160，629～633，2003)；而且要从FRET效率中得到分子的距离信息，还必须取得分子对之间的R0(Forster半径，FRET的效率为50％时的供体、受体之间的距离)和分子偶极子取向因子κ2的可靠信息，否则就无法利用FRET效率进行精确的距离计算(Siegel R M，Sci STKE，Vol.38，PL1，2000；Dietrich A，Biotechnology，Vol.82，211～231，2002)。另一方面由于目前绝大多数的FRET技术依然是应用在整体细胞的水平，得到的是系综平均的结果，这掩盖了来自单个分子对的独特信息。因此，生命科学的发展迫切需要提供新的方法和手段，来解决分子之间相互作用的检测问题。
技术实现思路
本专利技术针对上述在先技术对分子之间相互作用探测方面的不足，尤其是在体条件下探测的不足，提出一种在活细胞内关于膜蛋白分子之间相互作用的光学探测方法，以获得膜蛋白分子的相互作用的情况。本专利技术的技术解决方案如下一种膜蛋白分子之间相互作用的光学探测方法，其特征在于该方法包括下列步骤 第一步采用全内反射荧光成像系统探测细胞膜，对目标膜蛋白的不同区域获取多组膜蛋白的图像，每组图像对应细胞膜的一个区域，每组图像包含多幅分子序列图片；第二步利用计算机进行数据处理，绘制荧光强度与时间的关系曲线图，采用荧光强度与时间的关系曲线的淬灭次数判断图像中所含膜蛋白分子的数目；第三步采用中心定位法确定膜蛋白中每个分子的位置；第四步重复第二步和第三步对每组图像逐一进行数据处理，绘制淬灭步骤统计图和分子间距统计图，以获得膜蛋白的聚合程度和分子间距的统计结果。所述的第一步的具体步骤如下①为了进行荧光探测，对待测的目标膜蛋白分子做荧光标记；②将具有荧光标记的目标膜蛋白分子的活细胞置于全内反射荧光成像系统中，用高灵敏度CCD对细胞的不同区域拍摄多组膜蛋白分子的图像，每组图像对应一个区域，每组图像包含多幅分子序列图片；所述的第二步的数据处理的过程如下①对一组图像中的每一幅图片进行测量，得到荧光强度最大值或荧光强度平均值，绘制荧光强度与时间的关系曲线图，简称荧光强度图；②分析荧光强度图，该图中的荧光强度随时间的关系曲线呈现阶梯状的下降，荧光强度的第一次下降突变称为第一步淬灭，第二次下降突变称为第二步淬灭，第三次下降突变称为第三步淬灭，如此类推；该荧光强度曲线中，第一步淬灭之前的的区域称为a区间，第一步淬灭和第二步淬灭之间称为b区间，第二步淬灭与第三步淬灭之间称为c区间，……；根据荧光强度图的淬灭次数判断目标膜蛋白细胞的聚合程度一步淬灭说明没有发生蛋白的聚合，二步淬灭代表图片中含有两个分子，称为蛋白的二聚化，三步淬灭表明有三个分子，发生了蛋白的二聚化，以此类推。所述的中心定位法是一种数据处理方法，对两分子的膜蛋白的数据处理过程如下①将某一组目标膜蛋白图像的处于b区间的某一单个图片读入计算机，即获得一10×10的二维强度矩阵，称为原矩阵I1，该矩阵I1包含有分子1的荧光强度分布；②对原矩阵I1做统计直方图，该图中荧光强度分界值设定为图像的背景值B；③对原矩阵I1的荧光强度减去背景值B并进行插值处理，形成100×100的新矩阵I1’；④以下列公式(1)为曲线方程，I1’中的矩阵元为数据点，利用最小二乘法对图像进行拟合，得到图像的中心点即为分子1的位置坐标(x1，y1)，Nxy=N00·exp---(1)]]>式中(x1，y1)即点物体的中心位置；Nxy，N00分别是像素(x，y)处和中心位置(x1，y1)处的成像强度值；S是点扩散函数的半高全宽；⑤将a区间的某一图片读入计算机，即获得一10×10的二维强度矩阵，称为原矩阵I2，该矩阵I2包含有分子1和分子2的荧光强度分布；⑥将矩阵I2减矩阵I1，得到分子2的荧光强度分布矩阵并进行插值处理，形成分子2的100×100荧光强度分布新矩阵I2’；⑦本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种膜蛋白分子之间相互作用的光学探测方法，其特征在于该方法包括下列步骤：第一步采用全内反射荧光成像系统探测细胞膜，在细胞膜的不同区域获取多组目标膜蛋白分子的图像，每组图像对应细胞膜的一个区域，每组图像包含多幅膜蛋白分子的序列图片；　 　第二步利用计算机进行数据处理，绘制荧光强度与时间的关系曲线图，采用荧光强度与时间的关系曲线的淬灭次数判断图像中所含膜蛋白分子的数目；第三步采用中心定位法确定聚合的膜蛋白中每个分子的位置，由此确定膜蛋白的之间的间距；第四 步重复第二步和第三步对每组图像逐一进行数据处理，绘制淬灭步骤统计图和分子间距统计图，以获得膜蛋白的聚合程度和分子间距的统计结果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王琛，刘力，余琴，王桂英，徐至展，
申请(专利权)人：中国科学院上海光学精密机械研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]