一种耐热溶菌酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种耐热溶菌酶，其通过将人源溶菌酶基因导入到毕赤酵母进行表达制备，所述毕赤酵母为HFD

【技术实现步骤摘要】
一种耐热溶菌酶及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种耐热溶菌酶及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N
‑
乙酰胞壁质聚糖水解酶(N
‑
acetylmuramide glycanohydrlase)，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶，主要通过破坏细胞壁中的N
‑
乙酰胞壁酸和N
‑
乙酰氨基葡糖之间的β
‑
1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
[0003]目前应用最广泛的是鸡蛋清溶菌酶，鸡蛋清中含量丰富，抑菌功能显著，易于提取，且生产成本低，但是蛋清溶菌酶对热稳定性和变性剂的难受性较差，其作为饲料添加剂时，饲料造粒过程中有高温处理步骤，由于蛋清溶菌酶不耐受高温，活力受损，严重限制了应用。近年来，虽然市场上逐渐出现了利用微生物发酵的技术生产重组人溶菌酶，其对热稳定性和变性剂的耐受性有一定增强，且单位活力相对于鸡蛋清溶菌酶也较高，但其耐热性以及相关的抑菌性等方面还有待进一步提高；另外，现有的溶菌酶工业化生产工艺并不完善，其相关工艺条件有待进一步优化，发酵液中目标蛋白的分离浓缩技术也存在一定问题，这导致目的产物溶菌酶的纯度及产量均不理想。r/>
技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，构建性能优异的毕赤酵母菌株，并利用生物技术将耐热性、抗逆性较好的人源溶菌酶基因导入到真核细胞毕赤酵母中进行表达，同时优化溶酶菌生产工艺和产物浓缩纯化工艺以得到产率较高的高纯度耐热溶菌酶。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是：
[0006]本专利技术的第一个方面是提供一种耐热溶菌酶，其通过将人源溶菌酶基因导入到毕赤酵母进行表达制备，所述毕赤酵母为HFD
‑
01，其分类命名为毕赤酵母(Pichia pastoris)，其保藏编号为CCTCC NO:M2021148，保藏日期为2021年1月25日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。
[0007]进一步地，所述溶菌酶在温度100～120℃下的活力损失率不高于15％，所述溶菌酶在温度80～100℃下的活力损失率不高于10％。
[0008]本专利技术的第二个方面是提供一种本专利技术的第一个方面中任一所述的耐热溶菌酶的制备方法，其包括以下步骤：
[0009]步骤A.构建毕赤酵母HFD
‑
01，其保藏编号为CCTCC NO:M2021148；
[0010]步骤B.将热稳定的人源溶菌酶基因导入到步骤A构建的所述毕赤酵母HFD
‑
01中，以构建重组毕赤酵母菌株；
[0011]步骤C.采用步骤B构建的所述重组毕赤酵母菌株进行发酵培养，产物进行浓缩纯
化，以获得所述耐热溶菌酶。
[0012]为了进一步优化上述制备方法，本专利技术采取的技术措施还包括：
[0013]进一步地，在上述制备方法中，所述毕赤酵母HFD
‑
01的构建步骤包括：将出发菌株采用紫外灯
‑
白炽灯交替照射进行诱变，再采用常压室温等离子体照射进行诱变；将上述诱变获得的菌株采用温度梯度驯化筛选，以获得高耐受性、耐高温的毕赤酵母HFD
‑
01。
[0014]进一步地，上述毕赤酵母HFD
‑
01的构建步骤具体包括：将毕赤酵母GS115接种于YPD平板，28～30℃培养2
‑
3d，使用无菌水洗菌体，制成悬浮液，稀释至1
×
106个/mL，采用紫外灯
‑
白炽灯交替照射15～20次，其中：紫外灯(40W)照射60
‑
120s，距离约20～25cm，白炽灯(40W)照射1
‑
3min，距离约20～25cm，照射结束后将菌液加入YPD液体培养基中，常压室温等离子体照射40～100s，等离子体诱变条件为：100～120W，距离约1.5～3mm，氦气流速8～15L/min，诱变结束后将菌液加入YPD液体培养基中，28～30℃培养48h，以获得活力好及耐受性好的菌株；将上述诱变获得的菌株接种至YPD培养基中于28～30℃培养2
‑
3d，测定其OD
600
(大于1则认为适于生长)，依次将菌液转接至新鲜培养基中在30℃、32℃、35℃、38℃下进行培养，直至获得能在38℃下稳定生产且生长速度最快的毕赤酵母，将其命名为毕赤酵母HFD
‑
01，并进行保藏，其保藏编号为CCTCC NO:M2021148。
[0015]进一步地，所述重组毕赤酵母菌株的构建步骤包括：合成人源溶菌酶基因片段，其两端分别加入酶切位点；所述基因片段通过双酶切插入质粒中，构建质粒表达载体并进行单克隆扩增；将表达载体转化至所述毕赤酵母HFD
‑
01，并采用紫外灯
‑
白炽灯交替照射诱变，以获得能高效表达耐热溶菌酶的重组毕赤酵母菌株。
[0016]进一步地，上述重组毕赤酵母菌株的构建步骤具体包括：合成人源溶菌酶(HLM)基因片段，优选为耐热性、抗逆性较好的人源溶菌酶基因，其两端分别加入酶切位点Xho I和Not I；上述基因片段通过双酶切插入质粒pPicZαA中，构建表达载体pPicZαA
‑
HLM；利用大肠杆菌DH5α感受态细胞进行表达载体pPicZαA
‑
HLM的单克隆扩增；将表达载体pPicZαA
‑
HLM电转化至毕赤酵母HFD
‑
01，将上述重组菌株接种于YPD平板，30～35℃培养2
‑
3d，使用无菌水洗菌体，制成悬浮液，稀释至1
×
106个/mL，采用紫外灯
‑
白炽灯交替照射4～8次，其中：紫外灯(40W)照射30～60s，距离约20～25cm，白炽灯(40W)照射1～2min，距离约20～25cm，照射结束后将菌液涂布平板，30～35℃培养48h，以获得能稳定高效表达耐热溶菌酶的重组毕赤酵母菌株。
[0017]进一步地，所述重组毕赤酵母菌株的发酵培养步骤包括：采用所述重组毕赤酵母菌株制备成种子液进行一级和二级种子培养，培养后的种子液移入发酵罐进行发酵培养，发酵液进行浓缩纯化，喷雾干燥、过筛、包装，以获得溶菌酶成品；更进一步地，上述重组毕赤酵母菌株的发酵培养各步骤的培养条件控制如下：种子液制备：25～35℃、培养时间40～60h；一级种子培养：25～35℃、转速100～280rpm、通气量10～25m3/h、罐压0.03～0.06Mpa、培养20本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种耐热溶菌酶，其特征在于，所述溶菌酶通过将人源溶菌酶基因导入到毕赤酵母进行表达制备，所述毕赤酵母为HFD
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01，保藏编号为CCTCC NO:M2021148。2.根据权利要求1所述的耐热溶菌酶，其特征在于，所述溶菌酶在温度100～120℃下的活力损失率不高于15％，所述溶菌酶在温度80～100℃下的活力损失率不高于10％。3.一种如权利要求1或2所述的耐热溶菌酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤A.构建毕赤酵母HFD
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01，其保藏编号为CCTCC NO:M2021148；步骤B.将热稳定的人源溶菌酶基因导入到步骤A构建的所述毕赤酵母HFD
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01中，以构建重组毕赤酵母菌株；步骤C.采用步骤B构建的所述重组毕赤酵母菌株进行发酵培养，发酵产物进行浓缩纯化，以获得所述耐热溶菌酶。4.根据权利要求3所述的耐热溶菌酶的制备方法，其特征在于，所述毕赤酵母HFD
‑
01的构建步骤包括：将出发菌株采用紫外灯
‑
白炽灯交替照射进行诱变，再采用常压室温等离子体照射进行诱变；将上述诱变获得的菌株采用温度梯度驯化筛选，以获得高耐受性、耐高温的毕赤酵母HFD
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01。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈绍帮，陆荣亮，李久银，
申请(专利权)人：江苏海枫达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：