用于污泥处理的酶制剂制造技术

本申请提供了一种碱性污泥处理用酶制剂，包含溶菌酶、纤维素酶以及碱性丝氨酸蛋白酶PB92变体SPL

【技术实现步骤摘要】
用于污泥处理的酶制剂


[0001]本申请属于蛋白/酶制剂领域和环保领域，具体地，本申请提供了一种碱性污泥处理用酶制剂，包含溶菌酶、纤维素酶以及碱性丝氨酸蛋白酶PB92变体SPL
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12或SPL
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17，其中SPL
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12和SPL
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17氨基酸序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

技术介绍

[0002]污水处理的常用方法均包括将水中污染物、有机物、微生物等转移到污泥中以洁净水体的步骤，因此富含污染物、有机物、微生物的污泥的处理便成为了污水处理中的最关键和最根本的步骤，其处理成本占到污水处理成本的一半以上，也是污染排放达标的根本。
[0003]目前常用的污泥处理方式为填埋、自然干化、高温焚烧等，这些方法不仅有较高的二次污染风险，而且土地、燃料等成本也日益成为处理企业和政府的负担。为降低污泥处理的成分以及提高处理的可持续性，污泥的资源化是必然的选择，欧洲发达国家中污泥厌氧发酵处理占污泥处理总量的50％左右。
[0004]无论是以甲烷为产品的厌氧发酵还是以有机酸为产品的厌氧发酵，多需要水解以破解微生物细胞和胞外聚合物以提高厌氧发酵速率和效率，目前可用的酶包括纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、溶菌酶等(Dai XH et al.Simultaneous enhancement of methaneproduction and methane content in biogas from waste activated sludge and perennial ryegrass anaerobic co
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digestion:the effects of pH and C/N ratio，Bioresource Technology，2016，216：323
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330)。其中的蛋白酶是破坏污泥中的团聚物的主要作用酶，对破坏细胞也有作用。目前污泥处理中可使用的蛋白酶多为中性和酸性蛋白酶，对于呈碱性的污泥，如印染企业和某些有色金属冶炼加工企业的污泥以及经过碱处理的污泥效果不佳。选用适合的酶及配合成分配制适合的污泥处理酶制剂是解决这一问题的根本手段。

技术实现思路

[0005]为解决上述问题，申请人尝试使用了常见的PB92碱性蛋白酶处理污泥，发现蛋白溶出效果和产酸效果均不理想，推测原因是PB92的稳定性不佳造成作用时间超过2小时后酶活降低。随后申请人通过易错PCR的方法筛选PB92的稳定性变体，特别是低温稳定性改善变体，获得的SPL
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12、SPL
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17在此方面有明显的改善，辅以适合的络合剂，用于污泥厌氧发酵产酸时产酸量有明显提高。
[0006]一方面，本申请提供了一种污泥发酵产酸用酶制剂，包含溶菌酶、纤维素酶、碱性丝氨酸蛋白酶PB92变体以及络合剂，其中所述碱性丝氨酸蛋白酶PB92变体在氨基酸序列为SEQ ID NO.1的碱性丝氨酸蛋白酶基础上引入了选自S76D、P129E、S130K、G260H、S130A、A166D的突变。
[0007]进一步地，所述碱性丝氨酸蛋白酶PB92变体的稳定性提高。
[0008]进一步地，变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
[0009]进一步地，变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。
[0010]进一步地，所述络合剂为柠檬酸或EDTA。
[0011]另一方面，本申请提供了上述酶制剂在污泥厌氧发酵产酸中的应用。
[0012]进一步地，所述污泥为碱性污泥。
[0013]进一步地，产酸产品为丙酸。
[0014]进一步地，溶菌酶、纤维素酶、碱性丝氨酸蛋白酶PB92变体以及络合剂的用量分别为1
×
106U/g污泥干重、1
×
104U/g污泥干重、2
×
106U/g污泥干重、25
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40mg/g污泥干重。
[0015]本申请中的变体可以通过本领域公知的分子生物学和发酵工程方法生产，使用的宿主菌可以为分子生物学和发酵工程中的常用种类，包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌。
[0016]本申请中的污泥可以为含蛋白和多糖的工业污泥，生活污泥，农业污泥等，特别优选呈碱性的污泥，包括但不限于印染厂污泥，有色金属冶炼厂污泥，以及经过碱处理的生活污泥。
[0017]本申请中的发酵产酸产品包括但不限于乙酸、丙酸、丁酸、戊酸及其衍生物。
[0018]本申请中的发酵产酸所用菌种可以来自发酵效果好的污泥接种，也可以按照本领域对发酵菌株的研究，以纯培养菌株配制。
[0019]本申请中的柠檬酸、EDTA等可以选用纯度可用于发酵产酸的国产或进口种类。
附图说明
[0020]图1为亲本PB32、SPL
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12、SPL
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17的酶活
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pH曲线图；
[0021]图2为亲本PB32、SPL
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12、SPL
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17的酶活
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温度曲线图。
具体实施方式
[0022]主要试剂和仪器
[0023]福林试剂由上海联迈生物工程有限公司生产；
[0024]分光光度计754N由上海仪电分析仪器有限公司生产；
[0025]气相色谱仪7890B由安捷伦生产；
[0026]易错PCR试剂盒GeneMorph II random mutagenesis kit由安捷伦生产；
[0027]BCA蛋白浓度检测试剂盒由Solarbio生产；
[0028]浓硫酸
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苯酚检测糖浓度试剂盒由深圳子科生物科技有限公司生产；
[0029]基因工程菌和载体为申请人所在实验室自保存；
[0030]溶菌酶购自北京夏盛生物科技有限公司(标注40000U/mg，最适pH 6.5)；
[0031]纤维素酶购自河南铭之鑫化工产品有限公司(标注100U/mg，最适pH 6.0)；
[0032]柠檬酸和EDAT由国药集团生产；
[0033]实施例3和4所用污泥采集自东莞某镇工业园区污水处理厂二沉池(除少量写字楼办公/生活污水外，该污水处理厂的主要污水来源为临近三家印染企业)，基本指标为：TSS 13.2
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14.8g/L、VSS 10.9
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12.2g/L、SCOD 0.16
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0.18g/L(消解法)，pH为8.4
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8.9；
[0034]其他试剂和仪器均为常规国产种类。
[0035]蛋白酶活性测定方法：
[0036]使用福林法测定：在系列管中加入2mL所需pH的硼酸缓冲液配制的100ug/mL酵素溶液；将管在所需温度下保温5min；加入酶液1mL，混合后静置反应10min；加入3mL0.4M三本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种污泥发酵产酸用酶制剂，其特征在于，其包含溶菌酶、纤维素酶、碱性丝氨酸蛋白酶PB92变体以及络合剂，其中所述碱性丝氨酸蛋白酶PB92变体在氨基酸序列为SEQ ID NO.1的碱性丝氨酸蛋白酶基础上引入了选自S76D、P129E、S130K、G260H、S130A、A166D的突变。2.根据权利要求1的酶制剂，其中所述碱性丝氨酸蛋白酶PB92变体的稳定性提高。3.根据权利要求2的酶制剂，其中所述碱性丝氨酸蛋白酶PB92变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。4.根据权利要求2的酶制剂，其中所述碱性丝氨酸蛋白酶PB92变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。5.根据权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：林小丽，
申请(专利权)人：林小丽，
类型：发明
国别省市：