一种在生物液体中检测人血清白蛋白的方法技术

一种使用具有聚集诱导发射(AIE)特性的小分子荧光化合物检测生物流体中的人血清白蛋白(HSA)的方法，包括将生物流体与荧光探针混合后用紫外光照射混合物，在检测到可观察到的荧光发射时确定是否存在人血清白蛋白。荧光探针与生物流体中的人血清白蛋白结合，探针与人血清白蛋白结合产生发射。体液可以是尿液。这些探针可以是水溶性的，并且可以包括四唑标记的AIEgens。本方法可使用医院中的常规荧光光谱仪或使用HSA检测装置来执行。HSA检测装置是便携式的，可供患者在家使用。可供患者在家使用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种在生物液体中检测人血清白蛋白的方法


[0001]本专利技术总体上涉及一系列具有聚集诱导发光(AIE)特征的荧光探针用于检测生物流体中人血清白蛋白的方法。

技术介绍

[0002]慢性疾病的早期诊断和日常监测对疾病治疗十分重要。慢性肾病是一种常见的慢性疾病，在老年人或有糖尿病、高血压、泌尿道感染、急性胰腺炎等患者，以及正在服用对肾功能有损伤的药物的患者中十分常见。尿液是一种非侵入性的生物液体，是监测肾脏损害的理想分析物。
[0003]人血清白蛋白(HSA)是血浆中的主要蛋白质，除非肾脏功能异常和肾小球通透性异常升高，否则尿中通常不存在HSA。因此，尿液HSA浓度是与肾脏疾病密切相关的参数。例如，尿中HSA浓度在30mg/L至300mg/L的范围内，称为微量白蛋白尿，可能是早期肾脏疾病的信号。尿中HSA浓度超过300mg/L则为蛋白尿。
[0004]在医学检测中，磺基水杨酸测试和Heller测试已用于快速定性检测尿液中HSA的存在；比色法，例如Bradford和Lowry分析，也常用于蛋白质检测，但是这些测试通常缺乏准确性、敏感性或无法对蛋白质进行定量。如需定量检测，则会用到一些复杂，耗时且昂贵的方法，例如微芯片电泳，毛细管电泳，高效液相色谱，酶促免疫测定或比浊抑制免疫测定。
[0005]在商业市场中也有一些尿蛋白的检测产品，例如，干化学试纸可以用于定性检测尿蛋白的存在，并根据所用试纸和色标之间的颜色比较粗略估计尿蛋白的浓度，该方法虽然快速但缺乏准确性。胶体金免疫(层析)条也是一种可以半定量尿蛋白的方法，但此方法相对较贵且灵敏度不足。
[0006]胶体金免疫层析条也是一种广泛应用的半定量方法。只有当分析物金颗粒络合物在测试线上聚集到一定程度时，红色测试线才表明存在尿液HSA。金颗粒的标记是由于静电相互作用，但这不是一个足够稳定的物理吸附过程。此外，该方法相对昂贵且不够敏感。
[0007]荧光方法是一种更便宜，更灵敏，更简单的检测手段，如果荧光探针可以溶于水溶液，且仅在与HSA结合后才点亮，则可以在生物液体中灵敏地检测HSA的存在。另外，HSA浓度应与线性范围内的荧光强度成正比，因此，合适的水溶性点亮型荧光探针是定量检测HSA浓度十分理想的材料。
[0008]虽然已经报道了许多HSA特异性荧光探针，但是以前的荧光探针很少用于真实的尿液样本。例如，CN106153942、CN105572095A和CN1058355A中描述的现有探针基于扭曲分子内电荷转移(TICT)机制。“推拉”结构包括强电子供体(例如，二甲胺基)、可旋转桥(例如，双键)和强电子受体(例如，丙二腈基)在极性水溶液中通常不是很易于发射，但在相对非极性HSA腔中易于发射。因此，这些结构可以实现长波长发射。然而，它们大多是水不溶性的，并且需要有机共溶剂来溶解探针以进行检测。这对保持蛋白质构象是有害的。此外，由于这种探针对极性有反应，因此荧光可能会随着尿液样本pH值的变化而变化。
[0009]因此，非常需要一种克服这些挑战的在生物流体中检测HSA的方法。

技术实现思路

[0010]本专利技术涉及一种使用具有聚集诱导发光(AIE)特征的小分子荧光探针在生物流体中检测人血清白蛋白(HSA)的方法。该方法包括混合生物液体与荧光探针，用紫外线照射该混合物，以及当检测到荧光时确定人血清白蛋白的存在。当混合物中不存在HSA时，荧光探针在紫外灯下不能发出荧光，当混合物中有HSA存在时，荧光探针能与HSA结合并在紫外灯下发出荧光。生物液体可以是尿液。这类荧光探针包括具有四唑基的水溶性聚集诱导发光分子。这一方法需要用到常规的荧光光谱仪或可在家中使用的便携式紫外发射装置。
[0011]这类荧光探针具有的骨架结构举例如下：
[0012][0013]其中X是O或S；
[0014]其中R、R
′
、R”或R
”’
至少有一个独立地从以下的基团中选择：
[0015]其中R,R
′
,R”,和R
”’
中除了以上基团外的其他基团从以下基团中选择：氢、杂原子、烷基、非饱和烃基、含杂原子的烃基、环烃基、含杂原子的环烃基、芳香基、含杂原子的芳
香基。
[0016]在一个实施例中，荧光探针具有以下的骨架结构：
[0017][0018]其中至少有两个R和R
′
基团独立地从以下基团中选择：
[0019][0020]其中R和R
′
中除了以上基团外的其他基团从以下基团中选择：氢、杂原子、烷基、非饱和烃基、含杂原子的烃基、环烃基、含杂原子的环烃基、芳香基、含杂原子的芳香基。
[0021]在一个实施例中，荧光探针可以从以下结构中选取：
[0022][0023]附图说明
[0024]图1描绘了(A)在pH 7.4磷酸盐缓冲盐水(PBS)(包括[TPE
‑
4TA]＝5μM)中，不同浓度的HSA的荧光光谱；λex＝370nm；(B)(A)中对应的荧光峰强度，其中I0＝[HSA]＝0mg/L的荧光强度；(C)pH 7.4PBS(包括[TPE
‑
2TA
‑
a]＝5μM)中HSA的荧光光谱，λex＝370nm；(D)(C)对应的荧光峰强度，其中I0＝[HSA]＝0mg/L的强度；(E)pH 7.4PBS(包括[TPE
‑
2TA
‑
b]＝5μM)中HSA的荧光光谱，；λex＝370nm；(F)(E)对应的荧光峰强度，其中I0＝[HSA]＝0mg/L的强度；(G)pH 7.4PBS(包括[TPE
‑
2TA
‑
c]＝5μM)中HSA的荧光检测，；λex＝370nm；(H)(G)对应的荧光峰强度，其中I0＝[HSA]＝0mg/L的强度；
[0025]图2描绘了(A)在pH梯度下TPE
‑
4TA的荧光光谱，[TPE
‑
4TA]＝5μM；(B)pH梯度下490nm处TPE
‑
4TA及其对应的HSA
‑
(TPE
‑
4TA)复合物的荧光强度变化，其中[TPE
‑
4TA]＝5μM，[HSA]＝0.5μM；(C)TPE
‑
4TA探针对PBS中的生物分子的荧光响应，其中[TPE
‑
4TA]＝5μM，[生物分子]＝1mg/mL。I0:空白探针溶液490nm处的强度；(D)尿液中常见成分对PBS中HSA
‑
(TPE
‑
4TA)复合物在490nm处荧光强度的影响，其中[TPE
‑
4TA]＝5μM，[HSA]＝5μM，[尿液成分]＝10mg/mL。I0:空白TPE
‑
4TA溶液的荧光强度。
[0026]图3描绘了(A)连续注射TPE
‑
4TA滴定HSA时的ITC量热曲线本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于检测生物液体测试样本中人类血清白蛋白的方法，包括:混合生物液体样本与荧光探针；用紫外线照射混合物；在检测到可观察到的荧光发射时，确定人类血清白蛋白的存在，其中，荧光探针的骨架结构可从下列基团中选择:其中X是O或S；其中R、R
′
、R”或R
”’
至少有一个独立地从以下的基团中选择：其中R,R
′
,R”,和R
”’
中除了以上基团外的其他基团从以下基团中选择：氢、杂原子、烷基、非饱和烃基、含杂原子的烃基、环烃基、含杂原子的环烃基、芳香基、含杂原子的芳香基。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，荧光探针具有以下的骨架结构：
其中至少有两个R和R
′
基团独立地从以下基团中选择：其中R和R
′
中除了以上基团外的其他基团从以下基团中选择：氢、杂原子、烷基、非饱和烃基、含杂原子的烃基、环烃基、含杂原子的环烃基、芳香基、含杂原子的芳香基。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，荧光探针可以从以下结构中选取：
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，荧光探针和生物液体中的人血清白蛋白结合，结合物具有在紫外光下发射荧光的能力。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，生物液体是人的尿液。6.一种用于检测生物液体测试样本中人类血清白蛋白浓度的方法，包括：根据权利要求1所述的方法，检测生物液体测试样本中人类血清白蛋白的存在；测量检测到的发射的荧光强度；以及基于生物液体参考样本中的已知人血清白蛋白浓度与当荧光探针添加到生物液体参考样本中时产生的荧光强度之间的预定相关性来确定生物液体中的人类血清白蛋白浓度。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，生物液体测试样本是人类尿液，生物液体参考样本是单独的人类尿液样本。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，通过以下方法确定预定相关性：获得多个人类尿液参考样本；测定每个人类尿液参考样本中的人类血清白蛋白浓度；将每个尿液参考样本分成第一部分和第二部分；将荧光探针添加到每个参考样本的第一部分以提供多个目标样本；向每个参考样本的第二部分添加磷酸盐缓冲液以提供多个空白样本；在最大波长发射下获得每个参考尿液样本的目标样本和空白样本的荧光强度；从每个目标尿液参考样本的荧光强度减去空白样本的荧光强度，以提供每个参考人类尿液样本的参考荧光强度；绘制每个人类尿液参考样本的已知人类血清白蛋白浓度与相应参考强度的线性曲线以提供校准曲线，该校准曲线提供预定相关性。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，每个目标样本中尿液与荧光探针的体积比在1:6到1:12之间。10.一种用于检测生物液体中人类血清白蛋白浓度的装置，包括:由顶壁、底壁以及连接顶壁和底壁的多个侧壁所定义的空心外壳；样品入口窗口，限定在空心壳体的顶壁内；第一检测窗口和第二检测窗口，在顶壁内并且与样品入口窗口间隔；样品垫，设置在样品入口窗口下方的壳体内；共轭衬垫，设置在与样品衬垫相邻的壳体内，所述共轭衬垫包括至少一种荧光探针，所述至少一种荧光探针具有聚集诱导发光性质；孵育垫，设置在壳体内，在样品垫对面与共轭垫相邻的一侧；所述第一检测垫，设置在壳体内，与所述孵育垫相邻并位于所述第一检测窗口下方，所述第一检测垫包括包括白蛋白特异性抗体的...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐本忠，谢胜，涂于洁，
申请(专利权)人：香港科技大学，
类型：发明
国别省市：