一种基于吖啶橙和碳点的比率荧光用于miRNA体外检测的方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，涉及一种基于吖啶橙和碳点的比率荧光用于miRNA体外检测的方法。该方法包括以下步骤：制备与吖啶橙发生荧光共振能量转移的碳点，吖啶橙作为供体而碳点作为受体，以待测miRNA的反义DNA链为探针；将待测miRNA溶液加至一定浓度的DNA探针溶液中于37℃孵育90分钟，加入吖啶橙溶液并吸附10分钟后，加入碳点溶液并静置10分钟；用荧光分光光度计测试上述混合溶液的荧光强度并计算出待测miRNA的浓度。本发明专利技术操作简便、灵敏度高、重复性和特异性好，是一种用于miRNA体外检测的可靠方法。测的可靠方法。测的可靠方法。

【技术实现步骤摘要】
一种基于吖啶橙和碳点的比率荧光用于miRNA体外检测的方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种基于吖啶橙和碳点的比率荧光用于miRNA体外检测的方法。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]癌症对于人类健康构成严重威胁。统计数据显示，结直肠癌在全球的发病率以及死亡率均位列各种癌症的第三位，并呈逐年上升趋势。研究表明，通过早期筛查、诊断和治疗可以降低癌症的死亡率。早期结直肠癌患者治愈率高，5年生存率可达90％，但由于结直肠癌起病隐匿，早期不易发现，超过一半的患者在确诊时即已发生转移。转移性结直肠癌患者的5年生存率仅为10％，因此，结直肠癌患者的及早诊断为后续治疗争取宝贵时间、降低死亡率至关重要。
[0004]当前广泛使用的结直肠癌诊断方法有结肠气钡双重造影或钡灌肠、CT检查、B超和结直肠镜等。尽管这些传统的结直肠癌诊断方法已经获得临床应用，但是它们存在诊断灵敏度低、对人体损伤大、成本高等缺陷。因此，需要研发更先进的结直肠癌检测方法。当前，液体活检逐渐发展起来并引发了广泛关注。液体活检实质上是一种分子诊断技术，通常被看作是体外诊断的一种延伸，它将检测样本由相关组织延伸至血液、体液等液体，并且每次检测只需少量体液即可。因而，相对于传统的肿瘤检测技术，液体活检具有取样部位多样、病变发现及时、安全无并发症、能够预测病情发展、指导精准治疗以及预后等优势。
[0005]miRNA具有组织特异性，能够在体液中稳定存在，是癌症早期诊断的可靠分子标志物，因而在肿瘤液体活检领域展现出广阔的发展前景。miRNA检测能够进行癌症的早期筛查、临床诊断、个性化用药指导、肿瘤耐药性检测和预后检测。将miRNA检测应用于结直肠癌的早期筛查具有重要的意义。随着新材料尤其是纳米材料的蓬勃发展，miRNA的材料学检测成为了一个研究热点。在各种材料学检测方法中，荧光法因为具有灵敏度高、分析便捷、快速等特点而引起了科研工作者的广泛关注。但是，传统的荧光检测法存在易受背景荧光干扰以及系统复杂成分淬灭作用的不足。比率型荧光探针通过不同荧光波长处信号强度变化的比值表达检测信息，可以避免由背景荧光干扰、探针浓度波动等外部因素带来的对定量检测结果的干扰。因此，有必要构建比率型荧光探针以实现对包括结直肠癌特异性miRNA在内的各种疾病特异性miRNA的灵敏、特异性检测。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是针对当前miRNA检测方法存在的不足，提出一种基于吖啶橙和碳点的比率荧光用于miRNA体外检测的方法。该方法以柠檬酸和甲酰胺为反应物制备碳点，碳
点与吖啶橙组成荧光共振能量转移体系实现对miRNA的比率荧光检测，其中吖啶橙为供体而碳点为受体。
[0007]本专利技术首先将待测miRNA溶液加入DNA探针溶液中，通过孵育使两者发生碱基互补配对，继而加入能够吸附于单链核酸的磷酸根和嵌入双链核酸的碱基对中的吖啶橙，最后加入表面带负电的碳点。吸附于单链核酸的吖啶橙能够随未发生碱基互补配对的DNA探针吸附于碳点的表面发生荧光共振能量转移，使得吖啶橙的荧光强度减弱而碳点的荧光强度增强；反之，嵌入双链核酸的碱基对中的吖啶橙能够随发生碱基互补配对的DNA探针/miRNA双链不吸附于碳点的表面而不发生荧光共振能量转移，不会导致吖啶橙荧光强度的减弱和碳点荧光强度的增强。测试溶液的吖啶橙/碳点荧光强度比值，依据miRNA浓度与吖啶橙/碳点荧光强度比值之间的标准曲线计算出待测miRNA溶液的浓度。
[0008]本专利技术操作简便、灵敏度高、重复性和特异性好，是一种用于miRNA体外检测的可靠方法。
[0009]本专利技术的技术解决方案是：
[0010]一种基于吖啶橙和碳点的比率荧光用于miRNA体外检测的方法，该方法包括以下步骤：
[0011](1)将1.8g柠檬酸溶解于30mL甲酰胺中并转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，于180℃反应6小时，待反应釜自然冷却至室温后向反应溶液中加入120mL丙酮并放至冰箱中，于
‑
20℃放置24小时产生碳点沉淀，以10000转/分钟离心20分钟分离碳点沉淀，将碳点沉淀加至30mL甲醇体积占10％的甲醇/丙酮混合液中，以10000转/分钟离心洗涤20分钟，重复离心洗涤3次后将碳点重新溶解于10mL甲醇中，用孔径为0.22μm的滤膜过滤除去大颗粒，向碳点的甲醇溶液中加入30mL丙酮，以10000转/分钟离心洗涤20分钟，于50℃干燥12小时得到红棕色碳点；
[0012](2)配制浓度为10nM的DNA探针溶液，向292μL DNA探针溶液中加入3μL待测miRNA溶液，于37℃孵育90分钟；
[0013](3)向(2)的溶液中加入3μL浓度为1.76μM的吖啶橙溶液，吸附10分钟；
[0014](4)向(3)的溶液中加入2μL浓度为0.1mg/mL的(1)中制备的碳点溶液，静置10分钟；
[0015](5)用荧光分光光度计测试(4)中溶液的荧光强度，计算miRNA的浓度。
[0016]所述(2)～(4)中所有溶液的溶剂均为超纯水。
[0017]所述DNA探针的序列为(5
’‑3’
)：ACAGGCCGGGACAAGTGCAATA。
[0018]所述待测miRNA(hsa
‑
miR
‑
92a
‑
3p)的序列为(5
’‑3’
)：UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU。
[0019]所述荧光分光光度计的参数设定：激发波长为492nm，发射波长检测范围为512～675nm。
[0020]本专利技术的有益效果在于：
[0021]本专利技术通过构建以吖啶橙为供体和碳点为受体的荧光共振能量转移体系实现了对miRNA简便、灵敏、重复性好的比率荧光检测。该方法能够检测0.5～10nM浓度范围的miRNA。该方法不仅能够检测结直肠癌特异性miRNA(hsa
‑
miR
‑
92a
‑
3p)，也可以检测其它疾病特异性的miRNA，在肿瘤疾病检测领域具有广阔的应用前景。本专利技术可为miRNA的灵敏、特异性检测提供新途径，推动生物检测
的发展。
附图说明
[0022]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0023]图1为实施例1制备的碳点的透射电镜图；
[0024]图2为实施例1制备的碳点的Zeta电位图；
[0025]图3为吖啶橙的荧光发射和实施例1制备的碳点的荧光激发光谱；
[0026]图4为实施例1中不同浓度的miRNA溶液的荧光强度图；
[0027]图5为实施例1的标准曲线。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于吖啶橙和碳点的比率荧光用于miRNA体外检测的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：以柠檬酸和甲酰胺为反应物，采用溶剂热法制备出碳点；以吖啶橙为供体，所述碳点为受体，待测miRNA的反义DNA链为探针，采用比率荧光法定量测定miRNA的浓度。2.如权利要求1所述的基于吖啶橙和碳点的比率荧光用于miRNA体外检测的方法，其特征在于，所述柠檬酸和甲酰胺的体积比为0.04～0.06：1。3.如权利要求1所述的基于吖啶橙和碳点的比率荧光用于miRNA体外检测的方法，其特征在于，所述溶剂热法的反应条件为：140～200℃反应4～12小时。4.如权利要求1所述的基于吖啶橙和碳点的比率荧光用于miRNA体外检测的方法，其特征在于，溶剂热反应完成后，冷却至室温、加入丙酮、冷冻至产生碳点沉淀，分离，洗涤、过滤、干燥，得到红棕色碳点。5.如权利要求1所述的基于吖啶橙和碳点的比率荧光用于miRNA体外检测的方法，其特征在于，所有溶液的溶剂均为超纯水。6.如权利要求1所述的基于吖啶橙和碳点的比率荧光用于miRNA体外检测的方法，其特征在于，所述DNA探针的序列为5
’‑3’
：ACAGGCCGGGACAAGTGCAATA；或，所述待测miRNAhsa
‑
miR

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋妍彦，杜鲁涛，孙志伟，童尧，王凤龙，岳寿伟，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：