一种针对植物单细胞测序样本处理破碎的方法技术

本发明专利技术公开了一种针对植物单细胞测序样本处理破碎的方法，所述方法包括对植物样品进行物理破碎处理；对所述植物样品通过加入酶解液后得到酶解混合物，在pH6.0下温度控制在25

【技术实现步骤摘要】
一种针对植物单细胞测序样本处理破碎的方法


[0001]本专利技术属于植物单细胞检测
，尤其涉及一种针对植物单细胞测序样本处理破碎的方法。

技术介绍

[0002]生物资源是研究生物起源、变异和发展方向的重要资源，不管是单细胞生物还是由从生物组织中分离的单细胞，都具有重要的研究价值。典型的单细胞生物资源包括细菌、真菌、古菌等，这些微生物细胞数量和种类繁多。不同种属的功能性微生物在食品发酵、有机物降解等领域具有广泛应用。很多功能性微生物单细胞存在于动植物组织中，与蛋白质、脂肪等其他杂质混在一起，难以对杂质进行分离。
[0003]动植物等生命物质是很多单细胞组成的高级生命体，可以进行复杂的生命活动。植物根茎叶以及动物内脏是单细胞分离的常见样品。从动植物组织中分离出单细胞并进行培养，对研究动植物器官功能、基因遗传突变性等也具有重要意义。然而，动植物组织中多个细胞蛋白质粘连在一起，且单细胞的生存活力远不如微生物，同样难以将杂质分离。
[0004]单细胞测序作为前沿技术，在动物、人细胞中的应用广泛，但是在植物领域的应用很少。综上，现有技术存在的问题是，大多数单细胞尺寸在大多几微米到几十微米之间，直径小，生物细胞与杂质难以分离，导致细胞纯度低，因此需要一种针对植物单细胞测序样本处理破碎的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种针对植物单细胞测序样本处理破碎的方法。
[0006]本专利技术包括以下步骤：
[0007]A对植物样品进行物理破碎处理；
[0008]B对所述植物样品通过加入酶解液后得到酶解混合物，在pH6.0下温度控制在25
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35℃进行酶解，所述酶解液包括纤维素酶，果胶酶，氯化钙，甘露醇，离析酶R
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10按照mol比30:1：50：600：1进行混合后制得；
[0009]C对所述酶解混合物进行过滤后分离单个细胞或者多组细胞用于测序样本的上机前置程序。
[0010]进一步地，所述植物样品为植物茎叶根系。
[0011]进一步地，所述酶解混合物的酶解温度优选为28℃。
[0012]进一步地，所述植物样品与所述酶解液的料液比为25
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30g:100mL。
[0013]进一步地，进行多组细胞用于测序样本时，对所述酶解混合物进行过滤后加入洗涤液重悬沉淀得到去中间层的烟草细胞原生质体的悬浊液，所述洗涤缓冲液为：100mM KCl，20mM MgCl2，0.1％(w/v)BSA，0.4M甘露醇PBS,0.1M Tris HCl。
[0014]与现有技术相比，本专利技术的一个或多个实施例可以具有如下优点：
[0015]本专利技术通过物理破碎和酶解的形式促进细胞从生物样品中溶出至水中，提高细胞
得率和纯度，采用多种方法建立、优化植物单细胞转录组测序样本的制备方法，获取的植物细胞纯度高、活性高，便于进行检测。
附图说明
[0016]图1植物单细胞测序样本处理破碎的方法的流程示意图；
[0017]图2植物单细胞测序样本处理破碎的方法的处理前后的对比示意图；
[0018]其中图A为处理前的烟草叶细胞；图B为处理后的烟草叶细胞
[0019]图3植物单细胞测序样本处理破碎的方法的拟南芥茎
[0020]处理前显微镜放大示意图；
[0021]图4植物单细胞测序样本处理破碎的方法的拟南芥茎
[0022]处理后显微镜放大示意图。
具体实施方式
[0023]下面将对本专利技术附图以及实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0024]下述实验数据，如未特别指明，则所述的方法和试剂均采用现有技术。
[0025]如图1所示，在本实施例子1中，包括以下步骤：
[0026]A对烟草叶片样品进行物理破碎处理用于单细胞的植物样本上机测序；
[0027]B对所述烟草叶片通过加入酶解液后得到酶解混合物，在pH6.0下温度控制在28℃进行酶解，所述酶解液包括纤维素酶，果胶酶，氯化钙，甘露醇，离析酶R
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10按照mol比30:1：50：600：1进行混合后制得；
[0028]C对所述酶解混合物进行高速梯度离心将植物细胞分离后用梯度稀释法获取单个植物细胞。
[0029]植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶(Cellulase)、半纤维素酶和果胶酶果胶酶(pectinase)能降解细胞壁成分，除去细胞壁。采用本专利技术处理后的植物细胞进行样本测序后，发现呈现单独植物细胞原生质体的观察效果更好。以烟草叶片为例子，如图2所示，，其中BF为明场光谱，FL为荧光光谱，最终AOPI染色发现，也能达到接团率20％左右。可以达到10X单细胞测序的要求，因此可以将植物细胞处理，进行单细胞测序的研究。
[0030]在本实施例子2中，用于毛白杨叶单细胞的植物样本高通量多细胞上机测序，高通量单细胞可以从植物的异质性的组织或器官中鉴定出稀有细胞，
[0031]包括以下步骤：
[0032]A对毛白杨叶样品进行物理破碎处理；
[0033]B对所述毛白杨叶通过加入酶解液后得到酶解混合物，温度控制在28℃进行酶解3小时，对所述植物样品通过加入酶解液后得到酶解混合物，在pH6.0下温度控制在27℃进行酶解，所述酶解液包括纤维素酶，果胶酶，氯化钙，甘露醇，离析酶R
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10按照mol比30:1：50：600：1进行混合后制得；
[0034]C对所述酶解混合物进行过滤后加入洗涤液重悬沉淀得到去中间层的烟草细胞原生质体的悬浊液。
[0035]在本实施例子3中，用于拟南芥单细胞的植物样本高通量多细胞上机测序，包括以下步骤：
[0036]A对拟南芥茎样品进行物理破碎处理；
[0037]B对所述拟南芥茎样品通过加入酶解液后得到酶解混合物，温度控制在35℃进行酶解，对所述植物样品通过加入酶解液后得到酶解混合物，在pH6.0下温度控制在30
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40℃进行酶解，所述酶解液包括纤维素酶，果胶酶，氯化钙，甘露醇，离析酶R
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10按照mol比30:1：50：600：1进行混合后制得；
[0038]C对所述酶解混合物进行过滤后加入洗涤液重悬沉淀得到去中间层的拟南芥细胞原生质体的悬浊液。
[0039]对所述酶解混合物进行过滤后加入洗涤液重悬沉淀得到去中间层的烟草细胞原生质体的悬浊液，所述洗涤缓冲液为：100mM KCl，20mM MgCl2，0.1％(w/v)BSA，0.4M甘露醇PBS,0.1M Tris HCl。
[0040]如图3和4所示，拟南芥茎细胞在处理前细胞紧簇在细胞壁内，在进行破碎酶解后，拟南芥茎细胞可以实现从拟南芥茎样品中溶出至水中，提高细胞得率和纯度。
[0041]分别对实施例1
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3取一滴原生质体于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种针对植物单细胞测序样本破碎处理的方法，其特征在于，包括：A对植物样品进行物理破碎处理；B对所述植物样品通过加入酶解液后得到酶解混合物，在pH6.0下温度控制在25
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35℃进行酶解，所述酶解液包括纤维素酶，果胶酶，氯化钙，甘露醇，离析酶R
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10按照mol比30:1：50：600：1进行混合后制得；C对所述酶解混合物进行过滤后分离单个细胞或者多组细胞用于测序样本的上机前置程序。2.根据权利要求1所述的针对植物单细胞测序样本处理破碎的方法，其特征在于，所述植物样品为植物茎叶根系。3.根据权利要求1所述的针对植物单...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晶，张永卓，傅博强，高运华，
申请(专利权)人：中国计量科学研究院，
类型：发明
国别省市：