一种基于噬菌体展示技术开发的ALK纳米抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于噬菌体展示技术开发的ALK纳米抗体及其应用。本发明专利技术所提供的纳米抗体，包含由CDR1、CDR2和CDR3组成的互补决定区；CDR1的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第21-28位；CDR2的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第46-52位；CDR3的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第91-107位。本发明专利技术利用骆驼PBMC细胞，构建出骆驼纳米抗体天然文库，并利用噬菌体展示技术，从文库中筛选获得了高亲和力的ALK纳米抗体噬菌体克隆，转化到大肠杆菌表达体系中进行大量表达，有效降低了ALK抗体的开发和生产成本，本发明专利技术ALK纳米抗体经临床样本的免疫组化验证，具有更高的灵敏度和特异性。有更高的灵敏度和特异性。

【技术实现步骤摘要】
一种基于噬菌体展示技术开发的ALK纳米抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及一种基于噬菌体展示技术开发的ALK纳米抗体及其应用。

技术介绍

[0002]近十年来，肺癌已经成为严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，发病率和致死率不断上升。据2018年卫生统计年鉴显示，我国每年新发肺癌病例达70余万，死亡率占我国恶性肿瘤死亡率的第一位。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌中最常见的类型，约占85％，5年生存率仅为15％。NSCLC根据不同的组织学类型可以分为腺癌(≥40％)、鳞癌(30％)以及较为少见的大细胞(large cell carcinoma,LCC)(10％)。随着肺腺癌和鳞癌个体化治疗方案的日趋不同，临床强烈要求对不同类型的NSCLC明确诊断。对于绝大多数手术切除病例而言，经充分取材均能够正确诊断，但病理医师在实际工作中经常面临的是小活检标本(占70％)的诊断，诊断靶点的重要性不仅体现在NSCLC不同组织学类型之间的诊断，还在于明确特征性的分子学改变，用于满足NSCLC个体化治疗和预后判断的需要。目前临床应用的个体化靶向治疗主要针对表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)基因突变性和间变性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase,ALK)融合基因阳性肺癌，这两种基因变异型肺癌均具有明确的分子靶点、靶点检测技术及上市的靶向药物，临床疗效得到明显提高。
[0003]2007年Soda等人首次报道了NSCLC患者中存在由于染色体重排导致的间变性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase,ALK)基因与其他基因的融合，其中，最常见的ALK基因重排的融合变异为2号染色体短臂倒位[inv(2)(p21p23)]，形成EML4-ALK融合基因，编码含EML4的氨基末端和ALK的胞内酪氨酸激酶域的融合蛋白生成。目前，已经有三代ALK靶向药物(克唑替尼、色瑞替尼、艾乐替尼)应用于临床治疗。ALK重排阳性患者的药物耐药性问题和副作用更小，整体治疗效果更好，因此ALK靶点也被誉为NSCLC领域的“钻石靶点”。
[0004]目前针对ALK融合基因检测常用的方法主要有3种：荧光原位杂交(fluorescent insitu hybridization，FISH)、基于聚合酶链反应(PCR)扩增基础上的技术[cDNA末端快速扩增PCR(RACE-PCR)或逆转录(RT)-PCR联合测序技术、即时荧光定量RT-PCR反应(real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction，qRT-PCR)等]和针对融合蛋白表达的免疫组织化学法(IHC)。FISH虽然是临床试验验证的标准方法，步骤繁多复杂，容易信号丢失从而造成假阴性的结果，且只能判断ALK基因是否断裂，而无法区分与其发生融合的基因是什么，RNA检测只能定性间接反映检测基因的表达情况，无法检测蛋白质的定量表达情况，且FISH检测存在经济适用性的问题；RT-PCR对标本取材要求较高，需专用的试剂盒进行检测；IHC方法操作简单，特异性强，敏感度高，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学研究的深入是十分有意义的。IHC特异性强和敏感度高等优点取决于有亲和力高特异性强的抗体，但是目前用于IHC方法的ALK抗体被价格昂
贵的进口产品垄断，Cell Signaling Technology公司的D5F3抗体和Abcam公司的5A4抗体的准确度分别为100％和95％－99％。Roche VENTANA公司利用D5F3抗体并结合自身显色技术研制出ALK(D5F3)CDx试剂盒，先后获得CFDA和FDA批准，作为靶向药物克唑替尼和色瑞替尼的伴随诊断试剂。我国在ALK免疫诊断领域的研究严重滞后，国产抗体无法满足NSCLC患者的需求。
[0005]现自1993年Hamers等在骆驼血液中发现了天然缺失轻链的重链抗体后，纳米抗体(Nanobody,Nb)逐渐取代其他的小型抗体，逐渐成为新型抗体药物研发的热点。Nb通常只有15KDa左右，约传统抗体大小的十分之一，其内部存在二硫键，表面有大量亲水残基，对热和pH有较强的抵抗力；Nb缺乏Fc段和轻链的性质使其能够识别传统抗体无法识别的隐蔽表位或小表位，且避免了补体反应；此外，纳米抗体还具有稳定性高、毒性低、可溶性强、易于靶点筛选，和易于在原核微生物中直接表达，经济性好等诸多优势。序列同源性分析显示，骆驼Nb的VHH胚系基因序列和人VH3高度同源，但CDR1和CDR3比人稍长，CDR3在三级结构中向外凸出，因而推测有更高的抗原结合的特异性和亲和力。检测抗体的前景巨大，但国内检测抗体仍然处于起步阶段。因此，开发我国国产化ALK检测抗体，满足我国国民对于检测抗体的迫切需求，具有深远而积极的意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术针对“现有技术对于ALK抗体的开发集中在单克隆兔源传统抗体，传统单克隆抗体筛选方法费时费力，传统抗体无法在原核体系表达，研发周期长，生产成本高，批间差异大，严重限制了我国ALK抗体的开发，完全不能满足我国NSCLC患者的诊断和治疗需求”这一问题，提供了一种基于噬菌体展示技术开发的ALK纳米抗体及其应用。
[0007]第一方面，本专利技术要求保护一种纳米抗体。
[0008]本专利技术所要求保护的纳米抗体，命名为F10，包含互补决定区；
[0009]所述互补决定区由CDR1、CDR2和CDR3组成；
[0010]所述CDR1的氨基酸序列为SEQ ID No1的第21-28位；
[0011]所述CDR2的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第46-52位；
[0012]所述CDR3的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第91-107位。
[0013]进一步地，所述纳米抗体由所述互补决定区和框架区组成。
[0014]更进一步地，所述纳米抗体可为下述A1)或A2)：
[0015]A1)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的纳米抗体；
[0016]A2)在SEQ ID No.1所示氨基酸序列的N端和/或C端连接上蛋白标签后得到的纳米抗体。
[0017]所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为His标签、Flag标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
[0018]在本专利技术的具体实施方式中，所述纳米抗体具体为在SEQ ID No.1所示氨基酸序列的C端连接HA和6His标签后得到的。
[0019]第二方面，本专利技术要求保护与所述纳米抗体相关的生物材料本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.纳米抗体，包含互补决定区；所述互补决定区由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述CDR1的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第21-28位；所述CDR2的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第46-52位；所述CDR3的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第91-107位。2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于：所述纳米抗体由所述互补决定区和框架区组成。3.根据权利要求1或2所述的纳米抗体，其特征在于：所述纳米抗体为下述A1)或A2)：A1)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的纳米抗体；A2)在SEQ ID No.1所示氨基酸序列的N端和/或C端连接上蛋白标签后得到的纳米抗体。4.与权利要求1或2或3所述纳米抗体相关的生物材料，为B1)至B12)中的任一种：B1)编码权利要求1或2或3所述纳米抗体的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系。5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于：所述纳米抗体的CDR1的编码序列为SEQ ID No.2的第61-84位核苷酸；和/或所述纳米抗体的CDR2的编码序列为SEQ ID No.2的第136-156位核苷酸；和/或所述纳米抗体的CDR3的编码序列为SEQ ID No.2的第271-321位核苷酸。6.根据权利要求4或5所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下任一：C1)核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA分子；C2)在严格条件下与C1)限定的DNA分子杂交且编码所述纳米抗体的DNA分子；C3)与C1)或C2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述纳米抗体的DNA分子。7.含有权利要求1或2或3所述纳米抗体...

【专利技术属性】
技术研发人员：任丙昭，欧阳冰洁，于颖佳，范广益，王媚娘，李新洋，杨乃波，刘心，
申请(专利权)人：青岛华大基因研究院，
类型：发明
国别省市：