一株重组酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一株重组酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用，所述重组酿酒酵母的Gis4基因失活。所述的重组酿酒酵母基因工程菌对比原始酿酒酵母菌株在游离发酵中絮凝特性明显增强，在固定化发酵中形成的生物被膜增多，增加了生物产量，缩短了发酵周期，提高了发酵效率。

【技术实现步骤摘要】
一株重组酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用
本专利技术属于基因工程及微生物
，具体涉及一株敲除Gis4基因的重组酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与在促进生物膜形成中的应用。
技术介绍
生物膜也称为生物被膜，是一种由微生物细胞和其分泌的胞外基质共同组成的生物聚集体，由微生物集群与其分泌出的多糖、蛋白、脂肪酸等形成膜状结构附着于载体表面。生物膜的存在，不仅作为屏障为细胞的生命活动创造了稳定的内环境，介导了细胞与细胞、细胞与基质之间的连接，而且还承担了物质转运、信息的跨膜传递和能量转换等功能，这些都是由生物膜的结构决定的。生物膜还作为一种重要的工业应用——固定化发酵。与游离细胞发酵相比，固定化发酵中所形成的生物膜能在发酵过程中表现出较高的底物耐受性和较快的发酵效率。通常条件下，常规的游离细胞发酵50g葡萄糖大约需要8h左右，而固定化细胞只需要6h就可以将糖转化为乙醇，展现了固定化细胞出色的发酵效率和发酵能力。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株敲除Gis4基因的重组酿酒酵母基因工程菌。本专利技术还要解决的技术问题是提供上述重组酿酒酵母基因工程菌的构建方法。本专利技术最后要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母基因工程菌的应用。专利技术思路：Gis4是建立对酿酒酵母中Na+和Li+离子的耐受性的系统的新组成部分。通过参与编码关键Na+/Li+出口泵的ENA1基因的转录调控，在获得耐盐性中发挥其功能。因此，本专利技术选取Gis4基因作为改造对象，构建重组酿酒酵母基因工程菌，以提高固定化发酵中生物被膜量，进而提高发酵效率和发酵能力为了解决上述第一个技术问题，本专利技术公开了一株重组酿酒酵母基因工程菌，所述重组酿酒酵母的Gis4基因失活。其中，所述酿酒酵母为SaccharomycescerevisiaeS288c，来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心。其中，所述Gis4基因失活后的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述Gis4基因失活前的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。为了解决上述第二个技术问题，本专利技术公开了上述重组酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以酿酒酵母的基因组DNA为模板，扩增得到Gis4基因的上游同源臂和下游同源臂；以质粒PUG6为模板，扩增得到抗性G418目的片段；(2)以步骤(1)得到的Gis4基因的上游同源臂、下游同源臂和抗性G418目的片段为模板，通过重叠PCR扩增，得到基因敲除片段；(3)将步骤(2)得到的基因敲除片段转化至酿酒酵母感受态中，即得重组酿酒酵母基因工程菌。步骤(1)中，扩增Gis4基因上游同源臂引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。步骤(1)中，所述Gis4基因上游同源臂的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。步骤(1)中，扩增Gis4基因下游同源臂引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。步骤(1)中，所述Gis4基因下游同源臂的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。步骤(1)中，扩增抗性G418目的片段引物的核苷酸序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示。步骤(1)中，所述抗性G418目的片段的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。步骤(2)中，所述重叠PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.6所示。步骤(2)中，所述基因敲除片段的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。步骤(3)中，利用含有500μg/mLG418的YPD培养基筛选获得阳性转化子，得到敲除Gis4基因的酿酒酵母基因工程菌。为了解决上述第三个技术问题，本专利技术公开了上述重组酿酒酵母基因工程菌在促进生物膜形成中的应用。进一步地，本专利技术公开了上述重组酿酒酵母基因工程菌在发酵制备乙醇中的应用。其中，所述重组酿酒酵母基因工程菌的种子液按照5％～20％的体积比接种于发酵培养基中；优选为按照10％的体积比。优选地，通过固定化发酵制备乙醇。其中，所述固定化发酵以天然有机载体、人工合成高分子载体、人工无机高分子材料、复合材料作为固定化介质。优选地，所述固定化发酵以棉纤维材料作为固定化介质。其中，所述固定化介质的浓度为10～70g/L，优选为40g/L。其中，所述发酵的温度为30℃-40℃。其中，所述发酵的时间为20-30h。其中，所述发酵的发酵培养基配方如下：55-110g/L葡萄糖，3-6g/L蛋白胨、0.5-1g/L硫酸铵、3-6g/L磷酸二氢钾、3-6g/L酵母膏、0.5-1g/L硫酸镁、0.05-1g/L七水合硫酸亚铁、0.05-1g/L七水合硫酸锌，溶剂为水。优选地，所述酵的发酵培养基配方如下：60g/L葡萄糖，4g/L蛋白胨、0.5g/L硫酸铵、3g/L磷酸二氢钾、3g/L酵母膏、0.5g/L硫酸镁、0.05g/L七水合硫酸亚铁、0.05g/L七水合硫酸锌，溶剂为水。有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下优势：本专利技术公开了一株敲除Gis4基因的酿酒酵母基因工程菌，由于原始菌株S288c在固定化发酵中生物被膜形成过少，导致其发酵周期较长，发酵效率较低，而敲除Gis4基因的酿酒酵母基因工程菌对比原始酿酒酵母菌株在游离发酵中絮凝特性明显增强，在固定化发酵中形成的生物被膜增多，增加了生物产量，缩短了发酵周期，提高了发酵效率。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术做更进一步的具体说明，本专利技术的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。图1为实施例1中Gis4基因上游、下游同源臂的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M：DNA分子量marker，up：Gis4F(521bp)，down：Gis4R(524bp)。图2为实施例1中G418抗性片段的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M：DNA分子量marker，G418：G418基因扩增片段(1357bp)。图3为实施例1中Gis4基因缺失转化子的PCR鉴定电泳图，其中，M：DNA分子量marker；W为原始对照组，1、2分别为两个阳性转化子(2402bp)。图4为实施例2中原始菌S288c(W)与Gis4基因敲除菌(△Gis4)在96孔板培养1天孔板染色脱色图。图5为实施例3中原始菌S288c(W)与Gis4基因敲除菌(△Gis4)在游离发酵与固定化发酵的发酵残糖数据。图6为实施例3中原始菌S288c(W)与Gis4基因敲除菌(△Gis4)在游离发酵与固定化发酵的发酵产物乙醇数据。具体实施方式下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1：重组菌S288c-△Gis4的构建一、Gis4基因敲除片段的构建(1)以原始酿酒酵母(Saccharomycescerevisi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株重组酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述重组酿酒酵母的Gis4基因失活。/n

【技术特征摘要】
1.一株重组酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述重组酿酒酵母的Gis4基因失活。


2.根据权利要求1所述重组酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母为SaccharomycescerevisiaeS288c。


3.根据权利要求1所述重组酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述Gis4基因失活后的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


4.权利要求1-3中任意一项所述重组酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以酿酒酵母的基因组DNA为模板，扩增得到Gis4基因的上游同源臂和下游同源臂；以质粒PUG6为模板，扩增得到G418片段；
(2)以步骤(1)得到的Gis4基因的上游同源臂、下游同源臂和G418片段为模板，扩增得到基因敲除片段；
(3)将步骤(2)得到的基因敲除片段转化至酿酒酵母感受态中，即得重组酿酒酵母基因工程菌。

【专利技术属性】
技术研发人员：应汉杰，蒋颖，陈勇，梁偲策，赵伟，朱家庆，张涛，余斌，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32