PYL3蛋白突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及PYL3蛋白(PYR样蛋白3)突变体、其制备方法及用途。

【技术实现步骤摘要】
PYL3蛋白突变体及其应用
本专利技术涉及PYL3蛋白(PYR样蛋白3)突变体、其制备方法及用途。
技术介绍
脱落酸(Abscisicacid，ABA)是植物体内合成的最重要激素之一，在植物响应生物或非生物胁迫方面起到非常重要的作用，其能调控种子萌芽、植物开花/花期、叶片脱落、植物抗寒、抗旱、抗盐等。具体地，ABA能够调控植物生长和发育的许多方面，如胚胎和种子的成熟和萌发过程，包括种子干旱抗性、休眠以及贮藏蛋白合成。ABA还参与调控植物对非生物胁迫的响应，包括干旱胁迫、冷胁迫和盐胁迫等。另外，ABA能调控果实的发育，在刺激果实内糖的积累、改良果实的产量和品质等方面发挥着重要作用。在过去的几十年内，ABA信号转导途径得到了广泛的研究。在ABA信号传导的过程中，ABA受体识别ABA是最关键的一步。若ABA受体出现功能障碍，细胞对ABA不能进行正常的识别，即使ABA浓度增加，也不会产生相应的生理反应；相反，ABA受体数量的增加可以增强细胞对ABA的敏感性，使植物在低浓度的ABA情况下敏捷地获得对逆境的抗性。所以说，ABA受体是调控植物抗逆性的关键蛋白之一。START超家族的PYR/PYL蛋白是近来唯一被认可的ABA受体(包含PYR1和PYL1-13，共14个家族成员)，PYR/PYL受体蛋白通过结合ABA产生构象变化，进而通过结合并抑制类型2C蛋白磷酸酶(PP2C)家族成员(包括ABI1(脱落酸脱敏的蛋白1)、ABI2、HAB1(脱落酸超敏感蛋白1)、PP2CA)的酶活，从而释放被PP2C抑制的SnRK2激酶活性，磷酸化激活下游的转录因子ABF/AREB，最终使农作物获得对各种逆境的抗性[1-3]。虽然PYR/PYL家族成员蛋白序列和结构的同源性很高，但是也存一些明显的差异，这可能也是14个成员均能识别结合ABA，却发挥ABA不同生理作用的根本原因。到目前为止，在PYR1/PYL家族14个成员之间在功能上有什么差异尚不清楚。目前研究发现的PYR/PYL蛋白都必须结合ABA以后，才能高效地结合并抑制PP2C家族蛋白发挥作用。然而，在遇到各种逆境(例如干旱，盐碱地和寒冷)时，植物体内往往不能大量和及时合成释放ABA，使得植物不能积极响应这些胁迫而无法抵御逆境。因此，亟需获得不依赖于ABA就能高效抑制下游PP2C家族蛋白的PYR/PYL蛋白。Assaf等人[4]最终确定三个PYR1突变体具有较好的组成型抑制HAB1的能力(不依赖ABA或无ABA存在的情况下)，但是其效果明显不如PYR1在ABA存在的情况抑制HAB1、ABI1以及ABI2的效果。此外，通过氨基酸序列比对，利用PYR1这三个突变体的突变位点在PYL2或者PYL9上改造对应的突变体，虽然它们均具有抑制PP2C的能力，但是在抑制效果上存在明显差异，且抑制ABI2的效果也明显不如野生型PYL2在ABA存在的情况下的抑制效果。此外，Assaf等人的PYR1突变体主要是针对PYR1与HAB1、ABI1或者ABI2相互作用界面上的氨基酸突变，除一个突变位点涉及促进PYR1上Gate6/L6的关闭外，其它两个或三个突变位点位于异源二聚体的相互界面上直接增强PYR1与HAB1、ABI1或ABI2的相互作用。这些突变位点存在一个明显缺点，即消除了野生型PYR1响应ABA后与HAB1、ABI1或者ABI2之间的原有结合力差异，导致PYR1突变体可能无差别地结合HAB1、ABI1或者ABI2。本专利技术提供了两类不依赖ABA即可高效抑制下游蛋白HAB1酶活的PYL3蛋白突变体：第一类突变体完全保留识别结合ABA的能力，并且不依赖ABA也能高效抑制下游蛋白HAB1酶活，如突变体PYL3V108KV107LV192F；第二类突变体识别结合ABA的能力严重受损，并且不依赖ABA也能高效抑制下游蛋白HAB1酶活，如突变体PYL3V108KV107FV192F、PYL3V108KV107LV192FL111F、PYL3V108KV107FV192FL111F，其中突变体PYL3V108KV107FV192FL111F完全丧失识别结合ABA能力。同时，本专利技术的突变位点主要针对PYL3的Gate6/L6的关闭，很少程度直接干涉PYL3与HAB1、ABI1或者ABI2的相互作用界面的作用力，故保留了野生型PYL3结合HAB1、ABI1或者ABI2时原有不同的结合强度和效率。
技术实现思路
在第一方面，本申请涉及突变的PYL3蛋白，与野生型PYL3蛋白的氨基酸序列SEQIDNO:1相比，所述突变的PYL3蛋白的氨基酸序列包含在第81、107、108、111、188和192位中一个或多个处的突变。在一个优选的实施方案中，所述PYL3蛋白包括突变F81A、V107L、V108A、V108E、V108K、V111F、F188A和V192F中的一个或多个突变。在一个优选的实施方案中，所述PYL3蛋白突变V108A、V108E、V108K、V108KV107LV192F、V108KV107FV192F、PYL3V108KV107LV192FL111F或V108KV107FV192FL111F。在第二方面，本申请涉及一种核酸分子，其核酸序列为编码前述第一方面的突变的PYL3蛋白的核酸序列。在第三方面，本申请涉及制备前述第一方面的突变的PYL3蛋白的方法，包括通过PCR方法在SEQIDNO:2所示的野生型PYL3蛋白的核酸序列中引入突变位点，并表达突变的核酸序列，从而获得突变的PYL3蛋白。在一个优选的实施方案中，所述突变对应于氨基酸序列SEQIDNO:1中的突变V108A、V108E、V108K、V108KV107LV192F、V108KV107FV192F、PYL3V108KV107LV192FL111F或V108KV107FV192FL111F。在一个优选的实施方案中，所述PCR采用SEQIDNO:9-44中所示的引物序列。在第四方面，本申请涉及前述实施方案中的PYL3蛋白或核酸分子用于制备抵御生物或非生物胁迫的植物的用途。在第五方面，本申请涉及制备抵御生物或非生物胁迫的植物的方法，包括在所述植物中引入前述实施方案中的PYL3蛋白，或在所述植物的基因组中引入编码所述PYL3蛋白的核酸分子，或在所述植物的基因组的PYL3蛋白编码序列中引入前述任一实施方案中的突变。在第六方面，本申请涉及前述实施方案中的PYL3蛋白的氨基酸序列。在第七方面，本申请涉及编码前述实施方案中的PYL3蛋白的核酸序列。在第八方面，本申请涉及包含前述任一实施方案的核酸分子的载体。在第九方面，本申请涉及包含第八方面的载体的细胞，优选植物细胞。附图说明图1PYR/PYL依赖于ABA抑制PP2C的信号传导分子机制[6]。(A)apo-PYL3晶体结构(PDB登录号：3KLX)，即没有结合(+)-ABA配体的PYL3蛋白，ABA有一个手性碳原子，自然界天然存在的ABA为(+)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种突变的PYL3蛋白，与野生型PYL3蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:1相比，所述突变的PYL3蛋白的氨基酸序列包含在第81、107、108、111、188和192位中一个或多个处的突变。/n

【技术特征摘要】
1.一种突变的PYL3蛋白，与野生型PYL3蛋白的氨基酸序列SEQIDNO:1相比，所述突变的PYL3蛋白的氨基酸序列包含在第81、107、108、111、188和192位中一个或多个处的突变。


2.权利要求1所述的PYL3蛋白，其包括突变F81A、V107L、V108A、V108E、V108K、V111F、F188A和V192F中的一个或多个突变。


3.权利要求2所述的PYL3蛋白，其包括突变V108A、V108E、V108K、V108KV107LV192F、V108KV107FV192F、PYL3V108KV107LV192FL111F或V108KV107FV192FL111F。


4.一种核酸分子，其核酸序列为编码权利要求1-3中任一项所述的PYL3蛋白的核酸序列。


5.一种制备权利要求1-3中任一项所述的PYL3蛋白的方法，包括通过PCR方法在SEQIDNO:2所示的野生型PYL3蛋白的核酸序列中引入突变位...

【专利技术属性】
技术研发人员：张星亮，张小丽，苏琪茹，姜含芳，唐根，
申请(专利权)人：深圳市儿童医院，
类型：发明
国别省市：广东;44