一种分离的莴苣Tr基因及其在控制莴苣对嗪胺灵过敏反应中的应用制造技术

本发明专利技术属于植物工程技术领域，公开了一种分离的莴苣

【技术实现步骤摘要】
一种分离的莴苣Tr基因及其在控制莴苣对嗪胺灵过敏反应中的应用
本专利技术属于植物工程
，具体涉及一种分离的莴苣Tr基因及其在控制莴苣对嗪胺灵过敏反应中的应用。
技术介绍
莴苣(LactucasativaL.)是菊科莴苣属植物，原产于地中海地区，是我国重要的蔬菜作物。依据其不同的形态及食用部位，莴苣可以进一步划分为叶用莴苣(即生菜，LactucasativaLinn.var.ramosaHort.)、茎用莴苣(即莴笋，LactucasativaLinn.var.angustataIrishexBremer)。生菜可进一步分为罗马生菜(Romaine)、结球生菜(Crisphead)、散叶生菜(Looseleaf)、奶油生菜(Butterhead)等(Zhangetal.2017)。部分莴苣种质，尤其是罗马莴苣(Romaine)种质，表现为对杀菌剂嗪胺灵过敏，在喷施嗪胺灵溶液或含有嗪胺灵的农药之后，过敏莴苣在24小时内产生坏死斑点并失水萎蔫(Maxon1979)。因此，对莴苣的种植和生产产生了不便。世界范围内，莴苣尤其是罗马莴苣被大量种植，因而具有非常重要的经济价值。2017年，莴苣基因组测序完成，为莴苣各种遗传性状的控制基因的克隆及其功能研究提供了便利。申请人发现，控制莴苣对嗪胺灵的过敏反应是由一个编码TIR-NBS-LRR类的抗病基因控制的。到目前为止，控制莴苣对嗪胺灵过敏反应的基因的类型及其分子机理均未被报道。因此，对控制莴苣对嗪胺灵过敏反应的基因的克隆及对其分子机理的解析具有重要的理论和应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种分离的莴苣Tr基因，所述基因编码的蛋白质为SEQIDNO.3所示，对应的CDS序列为SEQIDNO.2所示。本专利技术的另一个目的在于提供了莴苣Tr基因在控制莴苣对嗪胺灵过敏反应中的应用。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：莴苣对嗪胺灵过敏反应的相关基因Tr的获得：本专利技术通过利用对嗪胺灵过敏的罗马生菜(Romaine)与对嗪胺灵不过敏的结球生菜(Crisphead)进行杂交获得F1杂种，F1进一步自交获得F2代。利用F2代群体，联合BSR-seq和传统的遗传定位的方法，对控制莴苣对嗪胺灵过敏反应的基因进行图位克隆。对定位区间内参考基因组上的基因进行功能注释及序列分析，对F2代分离群体中的交换单株的单倍型分析之后，确定了候选基因，并通过转基因互补实验以及基因编辑实验验证了候选基因Tr编码对嗪胺灵的敏感性。该基因编码一个TIR-NBS-LRR类的抗病基因，属于TNL家族，Tr基因编码的白质为SEQIDNO.3所示，其CDS为SEQIDNO.2所示，Tr基因的全长为SEQIDNO.1所示。本专利技术的另一个目的在于提供了莴苣Tr基因在控制莴苣对嗪胺灵过敏反应中的应用；包括利用本领域的常规方式，将SEQIDNO.3所示蛋白质对应的核苷酸在不敏感莴苣中表达，获得的转基因植株的表型变为嗪胺灵敏感；或者利用突变、敲除或基因沉默等方式，将Tr在敏感莴苣中敲除，获得的纯合敲除的转基因植株的表型为嗪胺灵不敏感。以上所述的应用中，优选的，所述的嗪胺灵不敏感转基因植株包括SEQIDNO.4～SEQIDNO.9中的任一一个序列。本专利技术的保护内容还包括：检测SEQIDNO.3所示蛋白质对应的核苷酸，或SEQIDNO.1所示基因的试剂用于莴苣嗪胺灵敏感性的筛选或育种；SEQIDNO.3所示蛋白质对应的核苷酸或SEQIDNO.1所示基因制备嗪胺灵不敏感或嗪胺灵敏感的转基因莴苣；以上所述的莴苣，优选的，为罗马生菜(Romaine)或结球生菜(Crisphead)。更详细的技术方案见《具体实施方式》。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术首次提出了一个控制莴苣对嗪胺灵过敏反应的基因，对莴苣对嗪胺灵过敏反应的分子机理以及植物抗病生物学途径的研究具有重要的理论意义。作为首个克隆的控制莴苣对嗪胺灵过敏反应的基因。到目前为止，Tr基因从未被报道过参与任何植物对嗪胺灵的过敏反应。该基因在植物过敏反应和抗病生物学途径研究中有重要应用潜力，也可用于对转基因后代的marker-free个体的高通量选择。附图说明图1为敏感莴苣和不敏感莴苣在嗪胺灵溶液处理前(左)和处理24小时后(右)的表型示意图。图2为莴苣一号染色体的约120Mb处有一个控制莴苣对嗪胺灵过敏反应性状的遗传位点示意图。图3在不敏感莴苣中互补Tr基因可以使不敏感莴苣的表型变为敏感，在敏感莴苣中敲除Tr基因可以使敏感莴苣的表型变为不敏感。其中：(a)在不敏感莴苣中互补Tr基因，得到阳性互补转基因植株Tr-COM#1，Tr-COM#1的表型由不敏感变为敏感(左一、左二)；在敏感莴苣中敲除Tr基因，得到纯合敲除Tr基因的植株Tr-CR#1，Tr-CR#1的表型由敏感变为不敏感(右二、右一)；标尺为1cm；(b)转基因植株Tr-COM#1的T1代单株基因型与表型分析；S代表敏感表型；I代表不敏感表型；扩增出条带的孔道代表含有Tr转基因插入的植株；无扩增条带的孔道代表无Tr转基因插入的植株。具体实施方式本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。在本专利技术实施例中，不敏感莴苣为对嗪胺灵不敏感的结球生菜(Crisphead，PI536839)；敏感莴苣为对嗪胺灵敏感的罗马生菜(Romaine，PI344074)。实施例1：控制莴苣对嗪胺灵过敏反应的基因Tr的获得：1.莴苣对嗪胺灵过敏反应的遗传分析为分析控制莴苣对嗪胺灵过敏反应的基因的遗传规律，本专利技术采用对嗪胺灵敏感的罗马生菜(Romaine，PI344074)与对嗪胺灵不敏感的结球生菜(Crisphead，PI536839)作为亲本(图1)，进行杂交获得F1，进一步自交获得F2代群体(Yuetal.2020)。对F2代个体进行嗪胺灵溶液处理并对24小时之后的表型进行评估、记录及统计分析。在179株个体的F2群体中敏感表型的个体数量为134个，不敏感表型的个体数量为45个，敏感个体：不敏感个体＝134：45≈3:1(χ2＝0.0128<χ2(0.05,1)＝3.84,P>0.05)。显示控制莴苣对嗪胺灵过敏反应的表型是由单基因控制的质量性状。2.Tr基因的图位克隆为克隆上述F2代分离群体中控制莴苣对嗪胺灵过敏反应的基因，本研究采用了BSR-seq的分析方法。从F2群体中选取敏感性状单株20株和不敏感性状单株20株，取相同生长部位及大小的叶片混合后磨样，提取两个混池的总RNA，并进一步采用IlluminaHiseq2500平台对总RNA进行测序。将RNA测序数据比对到莴苣参考基因组(https://genomevolution.org/coge/GenomeInfo.pl？gid＝28333)上，采用SAMtools软件对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的控制莴苣对嗪胺灵过敏反应的蛋白，所述的蛋白为SEQ ID NO.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种分离的控制莴苣对嗪胺灵过敏反应的蛋白，所述的蛋白为SEQIDNO.3所示。


2.编码SEQIDNO.3所示蛋白的基因。


3.根据权利要求2所述的基因，所述的基因为SEQIDNO.1所示。


4.根据权利要求2所述的基因，所述的基因为SEQIDNO.2所示。


5.权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的基因在在控制莴苣对嗪胺灵过敏反应中的应用。


6.检测SEQIDNO.3所示蛋白质对应的核苷酸，或SEQIDNO.1所示基因的试剂在莴苣嗪胺灵敏感性的筛选中...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡汉晖，安光辉，陈炯炯，张维奕，余长春，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42