超表达西伯利亚白刺高亲和钾离子转运蛋白基因的转基因耐盐型杨树制造技术

本发明专利技术公开了超表达西伯利亚白刺高亲和钾离子转运蛋白基因的转基因耐盐型杨树。本发明专利技术提供了蛋白质，是如下1)或2)或3)所述的蛋白质：1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)在1)的N端或/和C端连接分子标签得到的共表达蛋白质；3)将1)中的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。本发明专利技术将盐生灌木西伯利亚白刺的关键耐盐基因NSHKT1转入84K杨，获得了耐盐、耐碱、抗氧化能力强的转基因杨树，为杨树在盐碱地带的应用提供了候选品种。

【技术实现步骤摘要】
超表达西伯利亚白刺高亲和钾离子转运蛋白基因的转基因耐盐型杨树
本专利技术属于生物
，涉及一种超表达西伯利亚白刺高亲和钾离子转运蛋白基因的转基因耐盐型杨树。
技术介绍
植物根部是直接接触土壤中Na+的器官，因此根部的Na+外排，地上部分细胞对Na+的区隔化集中以及阻止Na+向地上部的运输是决定植物耐盐性的重要机制。液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白(NHX1)将细胞质中的Na+逆浓度梯度运输到液泡中区隔化；细胞质膜上的Na+/H+逆向转运蛋白(SOS1)能够将细胞质中的Na+逆向运送到细胞外的高Na+环境中；高效钾离子转运蛋白(HKT1)能够将进入木质部的Na+卸载到木质部薄壁细胞并通过韧皮部运回到根部以防止Na+在植物地上部分积累。截止目前，所开发及应用的Na+/H+逆向转运蛋白基因，大多来自于拟南芥、番茄等甜土植物，而针对木本植物、特别是对盐生木本植物Na+/H+逆向转运蛋白基因的开发与研究较为匮乏。已有研究发现，盐芥ThSOS1的表达量约为拟南芥AtSOS1的8～10倍，而且在甜土植物水稻和盐生植物盐芥中发现了相似的SOS信号通路，表明高等植物可能共用一套耐盐调控机制。因此，开发利用盐生植物的Na+/H+逆向转运蛋白基因具有十分重要的意义。白刺(NirtariaL.)是蒺藜科(Zygophyllceae)白刺属的一种落叶小灌木，为盐生植物，主要分布在我国北部至西北部的内蒙古、宁夏、甘肃、青海和新疆等地，是干旱盐碱地带的建群种之一。白刺属植物的茎叶具有较厚的角质层、叶片被蜡质表皮毛、气孔内陷、栅栏组织和维管束发达、细胞内含物填充蜡质晶体，这些典型的旱生植物结构特征使其在抵御盐害中发挥作用。盐胁迫条件下较强的膜保护能力和膜修复能力，以及高效的胞内离子区隔化和渗透调节物质的积累能力赋予白刺属植物较强的耐盐性。内蒙古地区主要有四个种，即西伯利亚白刺(N.sibilicaPall)、唐古特白刺(N.tangutorumBobr)、泡泡刺(N.sphaerocarpaMaxim)和齿叶白刺(N.roborowskiiKom)，其中西伯利亚白刺表现出更强的耐盐能力。西伯利亚白刺具有极其重要的生态价值，由于其在自然生境中受到盐、碱、旱的三重胁迫，导致其具有较强的耐盐碱和耐干旱能力，蕴含着丰富的抗逆基因资源。因此，研究其耐盐机理，鉴定耐盐相关基因并应用于牧草、农林作物的耐盐性遗传改良，具有十分重要的意义。杨树是一种兼具经济和生态价值的多年生木本植物，因其生长快、产量高而被广泛应用于园林绿化、经济林和防护林。除胡杨外，大多数杨树品种对盐十分敏感，盐渍土对杨树生长产生不利影响。84K杨(Populusalba×Populusglandulosa)是1984年从韩国引进的一个白杨派无性系(雄株)，其生长速度快，适应性强，有较强的抗逆能力，而且其无飞絮，不会对环境造成污染，因而是杨树基因工程研究中的优良品种。84K杨虽然有较强的耐寒、耐旱能力，但其和大多数杨树一样对盐十分敏感，因而对其进行耐盐性遗传改良至关重要。由于包括杨树在内的木本植物的遗传转化获得转基因植物较为困难，存在周期长、转化率低等问题，使得通过转化耐盐基因改良杨树耐盐性的研究进展缓慢。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种蛋白质。本专利技术提供的蛋白质，是如下1)或2)或3)所述的蛋白质：1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)在1)的N端或/和C端连接分子标签得到的共表达蛋白质；3)将1)中的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。编码上述蛋白质的核酸分子也是本专利技术保护的范围。上述核酸分子为如下1)-7)任一所述的DNA分子：1)序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的DNA分子；2)序列表中序列1的第61-1722位核苷酸组成的DNA分子；3)序列表中序列1的第1-1843位核苷酸组成的DNA分子；4)序列表中序列1的第14-1777位核苷酸组成的DNA分子；5)在1)-4)中任一种序列的末端连接标签编码基因得到的共表达核酸分子；6)与1)-4)中任一种限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的DNA分子；7)在严格条件下与1)-4)中任一种限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的DNA分子。含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、转基因细胞或重组菌也是本专利技术保护的范围。上述的蛋白质或上述的核酸分子或上述的表达盒、重组载体、转基因细胞或重组菌在如下A-C中的应用也是本专利技术保护的范围；A、提高杨树耐受性；B、培育耐受性提高的杨树；C、培育耐盐、耐碱和/或耐氧化的杨树。本专利技术另一个目的是提供一种制备耐逆性提高的转基因杨树的方法，为如下1)或2)：1)所述的方法包括如下步骤：提高目的杨树中上述的蛋白质的含量和/或活性，得到转基因杨树；2)所述的方法包括如下步骤：提高目的杨树中编码上述的蛋白质的核酸分子的表达，得到转基因杨树；所述转基因杨树的耐逆性抗性高于所述目的杨树。上述方法中，所述耐逆性为耐盐性、耐氧化性和/或耐碱性。上述方法中，所述提高目的杨树中上述的蛋白质的含量和/或活性，或，所述提高目的杨树中编码上述的蛋白质的核酸分子的表达，均是将所述编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子导入所述目的杨树中。本专利技术将盐生灌木西伯利亚白刺的关键耐盐基因NSHKT1转入84K杨，获得了耐盐、耐碱、抗氧化能力强的转基因杨树，为杨树在盐碱地带的应用提供了候选品种。附图说明图1为扩增NSHKT1cDNA全长序列的PCR产物。图2为NSHKT1基因ORF区域的扩增和重组载体的构建；A.NSHKT1基因ORF区域的扩增产物；B.pBI101和pMD19T-NSHKT1的质粒双酶切产物；C,菌落PCR鉴定pBI101-NSHKT1重组质粒；M1：200bpDNAMarker；M2：DL15000DNAMarker；1：NSHKT1-ORFPCR扩增产物；2：pMD19T-NSHKT1质粒双酶切产物；3：pBI101质粒双酶切产物；4：重组质粒的PCR产物。图3为84K杨的遗传转化；(A)外植体的切割及预培养；(B)农杆菌侵染；(C)分化培养；(D)抗性筛选；(E)生根培养；(F)获得抗性植株(比例尺＝1cm)。图4为转NSHKT1基因84K杨的基因组PCR鉴定；M：200bpDNALadder；+：pBI101-NSHKT1重组质粒；UT：非转基因84K杨；H1-H15：转NSHKT1基因84K杨。图5为转NSHKT1基因84K杨的RT-PCR鉴定；UT：非转基因84K杨；H1-H15：转NSHKT1基因84K杨。图6为NSHKT1基因在非转基因及转基因84K杨中的表达水平；UT：非转基因84K杨；H1-H15：转NSHKT1基因84K杨；误差线代表三个独立实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质，是如下1)或2)或3)所述的蛋白质：/n1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；/n2)在1)的N端或/和C端连接分子标签得到的共表达蛋白质；/n3)将1)中的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。/n

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，是如下1)或2)或3)所述的蛋白质：
1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2)在1)的N端或/和C端连接分子标签得到的共表达蛋白质；
3)将1)中的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。


2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。


3.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下1)-7)任一所述的DNA分子：
1)序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的DNA分子；
2)序列表中序列1的第61-1722位核苷酸组成的DNA分子；
3)序列表中序列1的第1-1843位核苷酸组成的DNA分子；
4)序列表中序列1的第14-1777位核苷酸组成的DNA分子；
5)在1)-4)中任一种序列的末端连接标签编码基因得到的共表达核酸分子；
6)与1)-4)中任一种限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
7)在严格条件下与1)-4)中任一种限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。


4.含...

【专利技术属性】
技术研发人员：林晓飞，祁彩芬，李超然，张海东，闫春霞，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15