【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的生物医药的，具体涉及一种新型工程化外泌体、其制备方法及应用。
技术介绍
1、视神经损伤是由许多眼部疾病所导致的视功能损害,严重时会造成患者视神经的萎缩和视功能的不可逆丧失。临床上导致视神经萎缩的疾病有多种,如青光眼、视神经挫伤、视神经管骨折、遗传性疾病leber病、代谢性疾病，如糖尿病、神经节苷脂病、视神经炎和视神经病变等。尽管对视神经萎缩的治疗开展了大量研究工作，但其临床实际疗效不尽人意。视网膜神经节细胞(retinalganglion cells,rgcs)的丢失是视神经损伤导致视神经萎缩和致盲的共同途径。目前已报道的保护rgcs的治疗方法，主要包括：改善视神经乳头微循环、谷氨酸途径的抑制剂、增加神经营养因子、诱导热休克蛋白的表达及抗氧化治疗等。然而，由于视神经损伤是一种多细胞因子和分子机制的多因素复合疾病，上述方法仍无法有效地阻止视网膜rgcs的进行性凋亡。
2、近年来，有研究从视神经再生、视网膜干细胞移植、视网膜干细胞定向诱导分化等方面来寻求更好的治疗方法。然而视网膜干细胞仅存在于睫状上皮，干细胞来源有限，因此寻找其他组织来源的干细胞治疗成为视神经损伤基础研究的前景。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)是存在于多种组织中的多潜能的基质细胞，其具有丰富的神经营养物质和独特的免疫调节、抗氧化等特性，是目前最具临床应用前景的多能干细胞。研究表明，mscs的有益作用是通过旁分泌效应发挥功能，而非长期植入后的分化替代起作用。外泌体(exosomes)是细胞外囊泡中的一种
3、然而，mscs-exo需要进入rgcs，才可高效发挥功效。一方面，滴眼给药mscs-exo存在角结膜渗透性差以及血眼屏障，导致到达眼部视网膜mscs-exo的量非常有限；另一方面，经眼内玻璃体注射的给药方式又给眼睛带来更大的创伤和更多的感染风险。因此，通过一种有效的递送系统将mscs-exo导入rgcs，同时又不给眼睛造成侵入性损伤的新方法将为视神经损伤相关眼科疾病的治疗带来革命性进展。
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一在于提供一种新型工程化外泌体的制备方法，制备方法简单，硫醇化修饰的ctb通过巯基-马来亚酰胺点击化学反应制备出dspe-peg-ctb，其再通过脂插入法修饰在干细胞外泌体的膜上，制备出有神经节靶向性、免疫调节功能、促损伤组织修复作用的工程化外泌体ctb-fm-exo，能靶向受损的视神经节细胞。
2、本专利技术的目的之二在于提供一种新型工程化外泌体，能够逆转视神经节细胞损伤、解决视神经损伤相关疾病的临床治愈问题。
3、本专利技术的目的之三在于提供一种新型工程化外泌体的应用。
4、本专利技术的目的之四在于提供一种新型工程化外泌体的另一应用。
5、本专利技术实现目的之一所采用的方案是：一种新型工程化外泌体的制备方法，包括以下步骤：
6、(1)从包皮组织中分离、纯化外泌体；
7、(2)采用霍乱毒素b亚基单位(ctb)与硫醇化试剂反应，制备巯基化霍乱毒素b亚基单位(sh-ctb)；
8、(3)采用制备的sh-ctb与dspe-peg-mal反应制备磷酸乙醇胺磷脂偶联霍乱毒素b亚基单位(dspe-peg-ctb)；
9、(4)将制备的dspe-peg-ctb和步骤(1)分离纯化的外泌体分别与稀释液c混合，然后将二者在一定温度下孵育，除去未结合的ctb和稀释液c，得到工程化外泌体(ctb-fm-exo)。
10、优选地，所述步骤(1)中，具体步骤包括：将包皮组织内板真皮组织剪碎后原代培养5～7天，再进行传代培养；收集包皮间充质p3代干细胞培养上清液，去除死细胞及细胞碎片，然后采用复合凝胶柱结合akta pure 25大分子分离纯化设备来分离、纯化外泌体。
11、优选地，所述步骤(2)中，硫醇化试剂为2-亚氨基硫烷、3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯、n-琥珀酰亚胺-s-乙酰巯基乙酸酯中的至少一种。
12、优选地，所述步骤(2)中，ctb可为荧光标记剂偶联的ctb，所述荧光标记剂为alexafluortm 555、alexa fluortm 488、alexa fluortm 594中的至少一种，ctb与硫醇化试剂的摩尔比为1:1～100。
13、优选地，所述步骤(3)中，dspe-peg-mal中采用的peg的分子量为1000～5000，sh-ctb与dspe-peg-mal的摩尔比为1:1～1.5。
14、优选地，所述步骤(4)中，孵育温度为0～4℃，孵育时间为15～60min。
15、优选地，所述步骤(4)中，dspe-peg-ctb和外泌体的摩尔比为1:4～10。
16、本专利技术实现目的之二所采用的方案是：一种新型工程化外泌体，采用所述的制备方法制得。
17、本专利技术实现目的之三所采用的方案是：一种所述的新型工程化外泌体的应用，将所述新型工程化外泌体应用于制备治疗视神经损伤相关疾病的药物。
18、本专利技术实现目的之四所采用的方案是：一种所述的新型工程化外泌体的应用，将所述新型工程化外泌体应用于制备治疗视神经损伤相关疾病的鼻滴液药物。
19、本专利技术具有以下优点和有益效果：
20、1.本专利技术的制备方法，硫醇化修饰的ctb通过巯基-马来亚酰胺点击化学反应制备出dspe-peg-ctb，其再通过脂插入法修饰在干细胞外泌体的膜上，制备出有神经节靶向性、免疫调节功能、促损伤组织修复作用的工程化外泌体ctb-fm-exo，能靶向受损的视神经节细胞，方便其通过干细胞外泌体传递活性生物分子至损伤神经细胞、从而修复损伤细胞
21、2.本专利技术的制备方法制备了一种全新的工程化外泌体，能够逆转视神经节细胞损伤、解决视神经损伤相关疾病的临床治愈问题。
22、3.本专利技术的制备方法制备的工程化外泌体，能够改善天然外泌体眼底疾病治疗靶向性差的问题，ctb通过与神经节苷脂gm1受体结合，从而选择性靶向神经节细胞。将ctb修饰在干细胞衍生的外泌体表面，可使其产生对视神经节细胞的神经节苷脂gm1的靶向定向的作用。通过靶向受损的视神经节细胞并促进其修复因子分泌，以实现持久的神经保护。
23、4.本专利技术制备的工程化外泌体，可应用于利用工程化干细胞外泌体的鼻腔药剂来治疗视神经损伤，使许多眼病的居家治疗成为可能。
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1.一种新型工程化外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的新型工程化外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，具体步骤包括：将包皮组织内板真皮组织剪碎后原代培养5～7天，再进行传代培养；收集包皮间充质P3代干细胞培养上清液，去除死细胞及细胞碎片，然后采用复合凝胶柱结合AKTAPure 25大分子分离纯化设备来分离、纯化外泌体。
3.根据权利要求1所述的新型工程化外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，硫醇化试剂为2-亚氨基硫烷、3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-琥珀酰亚胺-S-乙酰巯基乙酸酯中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的新型工程化外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，CTB可为荧光标记剂偶联的CTB，所述荧光标记剂为Alexa FluorTM555、Alexa FluorTM488、Alexa FluorTM594中的至少一种，CTB与硫醇化试剂的摩尔比为1:1～100。
5.根据权利要求1所述的新型工程化外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中
6.根据权利要求1所述的新型工程化外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中，孵育温度为0～4℃，孵育时间为15～60min。
7.根据权利要求1所述的新型工程化外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中，DSPE-PEG-CTB和外泌体的摩尔比为1:4～10。
8.一种新型工程化外泌体，其特征在于：采用权利要求1-7中任一项所述的制备方法制得。
9.一种如权利要求8所述的新型工程化外泌体的应用，其特征在于：将所述新型工程化外泌体应用于制备治疗视神经损伤相关疾病的药物。
10.一种如权利要求8所述的新型工程化外泌体的应用，其特征在于：将所述新型工程化外泌体应用于制备治疗视神经损伤相关疾病的鼻滴液药物。
...【技术特征摘要】
1.一种新型工程化外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的新型工程化外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，具体步骤包括：将包皮组织内板真皮组织剪碎后原代培养5～7天，再进行传代培养；收集包皮间充质p3代干细胞培养上清液，去除死细胞及细胞碎片，然后采用复合凝胶柱结合aktapure 25大分子分离纯化设备来分离、纯化外泌体。
3.根据权利要求1所述的新型工程化外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，硫醇化试剂为2-亚氨基硫烷、3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯、n-琥珀酰亚胺-s-乙酰巯基乙酸酯中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的新型工程化外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，ctb可为荧光标记剂偶联的ctb，所述荧光标记剂为alexa fluortm555、alexa fluortm488、alexa fluortm594中的至少一种，ctb与硫醇化试剂的摩尔比为1:1～100。
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