一种用于花椰菜杂交种子纯度鉴定的SSR引物及方法技术

本发明专利技术公开了一种用于花椰菜杂交种子纯度鉴定的SSR引物及方法，本发明专利技术中的两对SSR引物均能产生父本特异性标记和母本特异性标记，特异性强；本发明专利技术的方法可将“津品56”花椰菜杂交种子与其它杂种以及父母本区分开来，快速检测出杂交种子的纯度；本发明专利技术的检测方法具有快速、准确、低成本、操作方便等优势，能够代替传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种用于花椰菜杂交种子纯度鉴定的SSR引物及方法
本专利技术属于生物
，涉及一种鉴定花椰菜杂交种子纯度的SSR引物及其应用。
技术介绍
花椰菜(Brassicaoleraceavar.botrytis)是十字花科芸薹属甘蓝种中以花球为产品的一个变种，其营养丰富、味道鲜美，并且含有多种吲哚衍生物，具有一定的抗癌作用，在世界上被广泛栽培和食用。据联合国粮食与农业组织(FAO)统计，2018年，我国种植面积、年总产量分别为54.7万公顷、1073.7万吨，是世界上花椰菜种植面积最大、总产量最高的国家。我国花椰菜育种以传统方式为主，侧重杂种优势利用，而杂种优势的充分表现与种子遗传纯度有着密切的联系。因此，种子纯度是衡量花椰菜杂交种子质量的重要指标，建立准确、高效、快速的花椰菜种子纯度鉴定体系有利于花椰菜种子高效准确的质量控制，具有重要的商业价值和现实意义。SSR(Simplesequencerepeat)分子标记技术具有数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高，以孟德尔方式遗传、呈共显性且扩增结果稳定、成本低、方法简单等特点，被广泛应用于作物遗传图谱、指纹图谱构建及种子纯度鉴定等研究中。现有技术中，已有利用SSR引物鉴定花椰菜种子纯度的报道，但全部是基于甘蓝等其它花椰菜近缘物种的基因组设计SSR引物，效率低且结果稳定性较差。至今，未见基于花椰菜基因组设计的SSR引物应用于花椰菜杂交种子纯度鉴定的报道。另外，相比传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，近年来发展成熟的毛细管电泳检测技术，是一种准确、快速、高效的SSR分子标记检测技术，它可以分离和识别最小1bp差异的DNA片段，为SSR分子标记的基因分型提供了有效的检测手段。传统的种子纯度鉴定方法是以播种后植株的田间形态观察为依据，其周期长、工作量大，且易受环境、季节因素影响，导致结果存在偏差。因此，开发快速、准确的种子纯度鉴定方法已成为种子科研单位和企业共同关注的课题。随着分子生物学的迅速发展，使从DNA分子水平上对品种纯度进行基因鉴定和分析成为可能。采用分子标记技术进行种子纯度鉴定是一种快速、便捷、准确、有效的方法。目前利用SSR分子标记技术鉴定花椰菜杂交种子纯度的技术还未见报道。“津品56”由天津市农业科学院蔬菜研究所育成，为秋陆地早熟花椰菜雄性不育新品种，成熟期55天左右。株型直立紧凑，内叶叠抱护球性好，适合密植。商品性状良好，生长势强，抗病性较好；单球质量约0.84kg，每亩产量2770kg，是理想的秋陆地栽培品种，已在全国范围内连续推广7年，市场反应良好，累计种植面积达2000hm2以上。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种用于花椰菜杂交种子纯度鉴定的SSR引物，所述引物能产生父本特异性标记和母本特异性标记，特异性强。本专利技术的目的之二还在于提供一种花椰菜杂交种子纯度的鉴定方法，该方法利用上述SSR引物，能快速、便捷、准确、有效的鉴定花椰菜杂交种子纯度。为实现以上目的，采用以下技术方案：一种用于花椰菜杂交种子纯度鉴定的SSR引物组，包括2对SSR引物，分别为BoSSR01和/或BoSSR02；所述2对SSR引物序列如表1：表1用于花椰菜杂交种子纯度鉴定的SSR引物组其中，所述花椰菜的品种为“津品56”。一种花椰菜杂交种子纯度鉴定的方法，包含以下步骤：(1)提取花椰菜父母本和杂交种子的DNA；(2)以花椰菜基因组DNA为模板，使用表1所述的2对SSR引物分别进行PCR扩增反应；(3)对扩增产物进行毛细管凝胶电泳检测；(4)对电泳检测结果数据进行分析，同时具有父母本共显性特征条带的杂交种子鉴定为真正的杂交种，缺少父本或母本任意一个特征带的均记为假杂种，并计算种子纯度。其中，种子纯度的计算方法为：种子纯度＝检测到的真正杂交种个数/种子检测总数×100％。所述步骤(1)中提取花椰菜父母本和杂交种子的DNA的方法为CTAB法。其中，所述步骤(2)中PCR扩增反应具体使用的是10μL反应体系：10×buffer1.0μL，25mMMgCL21.0μL，2mMdNTPs1.0μL，10μM正向引物与反向引物各1.0μL，0.5单位的TaqDNA聚合酶0.2μL，模板50ng，加ddH2O至10μL；扩增程序为：95℃3min，95℃15s、58℃15s、72℃30s循环35次，72℃7min。其中，所述步骤(2)中PCR扩增反应使用的96孔PCR板在扩增前只在1～95孔中加入扩增反应体系，最后H12孔不加任何试剂。具体地，1～95孔中加入的扩增反应体系为10μLPCR产物与1×15μLTE缓冲液的混合液；最后H12孔加入25μLDNALadder。具体地，步骤(3)中毛细管电泳检测步骤如下：(1)准备仪器：调整Agilent5300FragmentAnalyzerSystem：安装毛细管，其他参数按照系统默认值；试剂根据产品说明配制，加载Gel和Condition，更换InletBuffer、Marker，然后排空废液抽取组件和废液瓶。(2)上样：稀释后的PCR产物放置于机身对应的“1～3”位置。(3)样品分析：从下拉菜单中选择方法，并输入待测样品及SSR引物信息，运行电泳程序；(4)数据分析：使用Prosize3.0数据分析软件处理目的片段分离数据。步骤(3)电泳检测的进样电压2.0kV，时间30s；分离电压5.0kV，时间68min。利用本专利技术的引物组，其中，引物BoSSR01可扩增到172bp的母本共显性特征条带以及145bp的父本共显性特征条带；引物BoSSR02可扩增到145bp的母本共显性特征条带以及126bp的父本共显性特征条带。本专利技术的优点：该申请是依托2019年成功破译花椰菜基因组数据，利用生物信息学手段，全基因组范围内鉴定得到19126个SSR分子标记，随机挑选出均匀分布在染色体上的64个SSR分子标记并设计引物，以“津品56”及其父母本为材料，最终筛选出适用于花椰菜品种“津品56”中2对可扩增出共显性条带的SSR引物组，并与毛细管电泳技术相结合，能够有效的鉴定出“津品56”花椰菜杂交种子纯度。本专利技术中的两对SSR引物均能产生父本特异性标记和母本特异性标记，特异性强；本专利技术的方法可将“津品56”花椰菜杂交种子与其它杂种以及父母本区分开来，快速检测出杂交种子的纯度；本专利技术的检测方法具有快速、准确、低成本、操作方便等优势，能够代替传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。附图说明图1为以BoSSR01为引物，杂交种子津品56杂交种子毛细管电泳检测结果；图中，泳道1为母本，泳道2为父本，泳道3～52为待检测F1代杂交种，泳道M为35-500bpladder；图2为以BoSSR02为引物，杂交种子津品56杂交种子毛细管电泳检测结果；图中，泳道1为父本，泳道2为母本，泳道3～52为待检测F1代杂交种，泳道M为35-500本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于花椰菜杂交种子纯度鉴定的SSR引物，其特征在于：所述SSR引物分别为BoSSR01和/或BoSSR02；所述2对SSR引物序列如下：/n

【技术特征摘要】
1.一种用于花椰菜杂交种子纯度鉴定的SSR引物，其特征在于：所述SSR引物分别为BoSSR01和/或BoSSR02；所述2对SSR引物序列如下：



所述花椰菜的品种为“津品56”。


2.一种花椰菜杂交种子纯度鉴定的方法，其特征在于：包含以下步骤：
(1)提取花椰菜父母本和杂交种子的DNA；
(2)以花椰菜基因组DNA为模板，使用权利要求1中所述的SSR引物进行PCR扩增反应；
(3)对扩增产物进行毛细管凝胶电泳检测；
(4)对电泳检测结果数据进行分析，同时具有父母本共显性特征条带的杂交种子鉴定为真正的杂交种，缺少父本或母本任意一个特征带的均记为假杂种，并计算种子纯度。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中提取花椰菜父母本和杂交种子的DNA的方法为CTAB法。


4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR扩增反应具体使用的是10μL反应体系：10×buffer1.0μL，25mMMgCL21.0μL，2mMdNTPs1.0μL，10μM正向引物与反向引物各1.0μL，0.5单位的TaqDNA聚合酶0.2...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚星伟，孙德岭，杨迎霞，陈锐，单晓政，牛国保，陆国清，王倩，张冠，王梦梦，
申请(专利权)人：天津市农业科学院，
类型：发明
国别省市：天津;12