水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测引物、试剂盒及方法。该双重PCR检测引物由特异性地针对水稻胡麻叶斑病菌Srm1基因的引物对和特异性地针对水稻稻黑孢霉菌tef1‑α基因的引物对组成，其序列如SEQ ID NO.1～4所示。基于所述的双重PCR检测引物，本发明专利技术还提供一种水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测试剂盒和检测方法，可快速、准确地对两种病原菌以及引起的水稻病害进行区分，避免错误的病害识别，其扩增效率高，检测方法简单，耗时短，靶标检测特异性强、结果易读，检测结果可帮助快速地制定相应的精准防治方案，防止病害扩散与蔓延，保障水稻生产安全。

【技术实现步骤摘要】
水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测引物、试剂盒及方法
本专利技术属于农作物病害防治及植物检疫领域，特别涉及水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测引物、试剂盒及方法。
技术介绍
中国是粮食生产大国，水稻种植面积在全球持续排在前列。根据国家统计局2019年主要农作物播种面积和产量的统计数据，我国水稻播种面积为2969万hm2，产量为20961万吨，水稻播种面积占粮食作物播种总面积的25.58％，产量占粮食作物总产量的31.58％，是我国第二大粮食作物，也是我国南方地区最重要的主食。水稻胡麻斑病，又称水稻胡麻叶枯病，是由平脐蠕孢属稻平脐蠕孢菌(Bipolarisoryzae)引起的一种水稻真菌性病害(Goodwinetal.,2006)。感染胡麻叶斑病菌的水稻叶片初期为褐色小点，逐渐扩大为椭圆形病斑，严重时连成不规则大斑。在每个水稻生产季节，该病害均会影响全世界范围内数百万公顷水稻的生产，特别是在缺水、缺营养的条件下(Barnwaletal.,2013)。水稻胡麻斑病是部分国家和地区的主要病害之一，除叶部症状外穗部也受害并导致千粒重下降及空秕粒增多，影响产量和米质。随着生产施肥水平不断提高和水利条件不断改善，该病害的危害已有所减轻，但在部分地区晚稻秧龄过长时可导致发病较多，并引起后期穗枯，且由于耕作方法和气候的改变，近年来该病在多个稻区又严重发生。黑孢霉属稻黑孢霉菌(Nigrosporaoryzae(Berk.etBr.)petch)，可引起水稻叶片产生黄褐至黑褐色病斑，病斑可扩展成黄褐色圆形或不规则黑褐斑，严重时可致整叶枯死、植株不能抽穗或结实，对水稻安全生产存在一定的威胁。该病原菌在1957年已被报道在日本东京侵染水稻引起了叶斑病，随后在全世界范围内有相关发生报道(冯爱卿等，2013年)，该病菌可在世界各地可流行分布，特别在热带地区发生普遍，可通过种子带菌和风雨传播，并可侵染冬小麦(Piechetal.,1993)、菩提树(Khodkeetal.,2009)、早熟禾(Zhengetal.,，2012)、棉花(Zhangetal.,2012)等。关于稻黑孢霉菌国内外尚未见到该水稻病原真菌的分子检测技术相关报道等。在国内，见有关于玉米裂轴病病原真菌-稻黑孢霉菌的分离、培养、形态特征等鉴定方法的专利，未涉及该病原菌的分子快速检测、诊断技术；在国外，有关于根据形态特征、ITS序列、致病性等进行病原菌鉴定的论文报道，同样未涉及该病原菌的分子快速检测、诊断技术。由于水稻育种水平的不断提高，挖掘水稻抗病种质资源，利用分子生物技术等辅助手段提高育种效率，促进了高产、优质、抗病水稻新品种或新组合的产生及应用，生产上的水稻主栽品种更新换代频率也随之加快，较大程度上改变了很多地方的水稻品种布局。对于自然界的病原菌来说，寄主—病原菌—环境三者关系也会发生较大变化，这也导致了一些次要病害在主要病害得到显著控制的情况下逐步上升为主要病害。水稻胡麻斑病菌和稻黑孢霉菌引起的水稻叶部病害近年已有逐渐上升的趋势，特别是在水稻生长中后期可对水稻生产造成较大危害，严重可导致水稻不能正常抽穗及结实。由于水稻胡麻斑病和稻黑孢霉菌引起的叶斑病在叶部病斑上较为相似，依靠病状较难判断，容易发生上述的误判，使得无法制定准确的防治措施并延误最佳防治时机。然而，传统的病原菌分离培养鉴定的方法耗时耗力，且同时依赖专业人员的扎实植物病理学背景。因此，为解决上述提到的病害误判和病原菌鉴定耗时长等问题，建立一套稳定、简便、快速、灵敏的双重分子检测方法以开展两种病原真菌和病害的同时检测、诊断是非常必要的，准确、快速的病害诊断可帮助有效、快速地制定精准防治方案，防止病害扩散与蔓延，确保水稻安全生产。然而，国内外尚未见到这两种主要病害的双重PCR检测方法或者其他分子检测方法的相关报道或专利申请，此外，在研究该两种病害、病原真菌的PCR检测方法方面也存在较大的技术难点，比如引起水稻叶斑类病害或穗部病害的水稻禾长蠕孢菌(Setosphaeriarostrata)和新月弯孢菌(Curvularialunata)等病原真菌与水稻胡麻叶斑病菌同属格孢腔菌目(Pleosporales)格孢腔菌科(Pleosporaceae)，亲缘关系较近，而水稻禾长蠕孢菌(Setosphaeriarostrata)、新月弯孢菌(Curvularialunata)、水稻层出镰刀菌(Fusariumproliferatum)等重要水稻病原真菌经常可在稻区为害(Alietal.,2020)，这使得开发水稻胡麻叶斑病菌的检测技术存在技术难点但也是非常有必要去解决的。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测引物。本专利技术的另一目的在于提供一种水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测试剂盒。本专利技术的再一目的在于提供所述水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测引物或试剂盒的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测引物，所述双重PCR检测引物由特异性地针对水稻胡麻叶斑病菌Srm1基因的引物对和特异性地针对水稻稻黑孢霉菌tef1-α基因的引物对组成，其中，水稻胡麻叶斑病菌Srm1基因的引物对的序列为：BO-Srm1-427F：5’-CGAGGACATGTAAGTAGCCCAA-3’(SEQIDNO.1)；BO-Srm1-1015R：5’-GATTTTAGTTGGGCGTGTTCAC-3’(SEQIDNO.2)；水稻稻黑孢霉菌tef1-α基因的引物对的序列为：NO-tef1-39F：5’-CGTCTTCGCACCATTTCACT-3’(SEQIDNO.3)；NO-tef1-420R：5’-TTGAGGAAAGATGGGCGACG-3’(SEQIDNO.4)。一种水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测试剂盒，含有上述水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测引物。所述的试剂盒还可以含有用于PCR扩增的基础试剂(溶液)：Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgCl2、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、TaqDNA聚合酶和ddH2O中的至少一种。所述的试剂盒进一步包括水稻胡麻叶斑病菌和/或稻黑孢霉菌的阳性对照DNA模板。一种用于检测或区分水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR方法，所述的方法包括使用所述的水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测引物和/或所述的水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测试剂盒进行双重PCR扩增的步骤。所述的用于检测或区分水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR方法，具体包括如下步骤：(1)提取待测样品的基因组DNA；(2)以提取的基因组DNA为模板，利用上述水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测引物进行双重PCR扩增反应，得到扩增产物；(3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测引物，其特征在于：所述的双重PCR检测引物由特异性地针对水稻胡麻叶斑病菌Srm1基因的引物对和特异性地针对水稻稻黑孢霉菌tef1-α基因的引物对组成，其中，/n水稻胡麻叶斑病菌Srm1基因的引物对的序列为：/nBO-Srm1-427F：5’-CGAGGACATGTAAGTAGCCCAA-3’；/nBO-Srm1-1015R：5’-GATTTTAGTTGGGCGTGTTCAC-3’；/n水稻稻黑孢霉菌tef1-α基因的引物对的序列为：/nNO-tef1-39F：5’-CGTCTTCGCACCATTTCACT-3’；/nNO-tef1-420R：5’-TTGAGGAAAGATGGGCGACG-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测引物，其特征在于：所述的双重PCR检测引物由特异性地针对水稻胡麻叶斑病菌Srm1基因的引物对和特异性地针对水稻稻黑孢霉菌tef1-α基因的引物对组成，其中，
水稻胡麻叶斑病菌Srm1基因的引物对的序列为：
BO-Srm1-427F：5’-CGAGGACATGTAAGTAGCCCAA-3’；
BO-Srm1-1015R：5’-GATTTTAGTTGGGCGTGTTCAC-3’；
水稻稻黑孢霉菌tef1-α基因的引物对的序列为：
NO-tef1-39F：5’-CGTCTTCGCACCATTTCACT-3’；
NO-tef1-420R：5’-TTGAGGAAAGATGGGCGACG-3’。


2.一种水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述的双重PCR检测引物。


3.根据权利要求2所述的水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测试剂盒，其特征在于：
所述的试剂盒还含有用于PCR扩增的基础试剂：Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgCl2、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、TaqDNA聚合酶和ddH2O中的至少一种。


4.根据权利要求2或3所述的水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR检测试剂盒，其特征在于：
所述的试剂盒还含有水稻胡麻叶斑病菌和/或稻黑孢霉菌的阳性对照DNA模板。


5.一种用于检测或区分水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重PCR方法，其特征在于：所述的方法包括使用权利要求1所述的双重PCR检测引物和/或权利要求2～4任一项所述的双重PCR检测试剂盒进行双重PCR扩增的步骤。


6.根据权利要求5所述的用于检测或区分水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重P...

【专利技术属性】
技术研发人员：张景欣，林壁润，张永强，王飞钊，沈会芳，杨祁云，蒲小明，孙大元，
申请(专利权)人：广东省农业科学院植物保护研究所，江门天禾农业服务有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44