本发明专利技术属于生物检测技术领域，涉及引物以及检测试剂盒，具体涉及一种用于紫菜赤腐病检测的两重PCR引物组及试剂盒，该引物组包含两组引物对，分别是检测Pythium porphyrae引物对和检测Pythium chondricola引物对。本发明专利技术的优点在于：(1)不需要用到测序技术，花费时间和钱财相对少；(2)可以同时完成两种病原的检测，对于两种病原同时存在或者只存在一种的情况均能检测到；(3)通过电泳片段大小即可判断病原，直观迅速。
【技术实现步骤摘要】
一种用于紫菜赤腐病检测的两重PCR引物组及试剂盒
本专利技术属于生物检测
，涉及引物以及检测试剂盒，具体涉及一种用于紫菜赤腐病检测的两重PCR引物组及试剂盒。
技术介绍
紫菜的养殖业是我国的重要的产业，近年来不断地由于养殖规模的不断扩大、环境污染和种质退化等原因，紫菜病害经常发生，其中的赤腐病是影响紫菜品种、产量最严重的病害。我国最早是在1996年报道了赤腐病的情况。据统计，2003年我国紫菜养殖场因为赤腐病的爆发使得紫菜产量降低了25％-30％，特别是在江浙一带更是下降了39％。目前我国对于赤腐病的研究仍较少，缺乏比较全面的赤腐病流行病学数据，因此我国对赤腐病的研究目前还处于初始阶段。在中国、韩国和日本，赤腐病是影响紫菜收益最主要的病害。赤腐病首先于1947年在日本由Arasaki报道并进行了研究，随后用了30年分离到其病原为卵菌Pythiumporphyrae以及Pythiumchondricola。虽然赤腐病的流行病学特征和该病原的生理特征目前已引起广泛关注，但在其侵染机制方面的研究仍然较少。莫照兰等于2016年发现了中国江苏连云港紫菜养殖场赤腐病的一种新的真菌病原——链格孢属。自此发现的紫菜赤腐病病原有三种，分别为Pythiumporphyrae、Pythiumchondricola、链格孢属，其中链格孢属仅有一株，几乎全部为腐霉属的两种菌。现有的检测技术是通过cox1序列的特异引物扩增，通过序列比对得知其分类。这样整个程序包括样品DNA提取、特异引物PCR扩增、电泳检测、产物序列测定，这就耗费大量的时间和测序的费用，效率低下。
技术实现思路
目前能引起紫菜叶状体赤腐病的病原主要是腐霉属的两种菌，分别是Pythiumporphyrae和Pythiumchondricola，依赖于测序技术针对这两种病原菌的鉴定方法，耗时长花费高。本专利技术提出了一种用于紫菜赤腐病检测的两重PCR引物组及试剂盒，能够依靠一轮PCR反应根据电泳条带大小即可判断病原种类，而且灵敏度高，可以检测到10个水体中的游动孢子。为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：一种用于紫菜赤腐病检测的两重PCR引物组，其特征在于，该引物组包含两组引物对，分别是检测Pythiumporphyrae引物对，目的片段长度在900bp左右，以及检测Pythiumchondricola引物对，目的片段长度在300bp左右，所述检测Pythiumporphyrae引物对包括SEQIDNO：1所示的上游引物P-for和SEQIDNO：2所示的下游引物P-rev，所述检测Pythiumchondricola引物对包括SEQIDNO：3所示的上游引物C-for和SEQIDNO：4所示的下游引物C-rev。其中，优选方案如下：所述检测Pythiumporphyrae引物对和检测Pythiumchondricola引物对的摩尔比为1：1。本专利技术还提供了一种用于紫菜赤腐病检测的两重PCR试剂盒，其特征在于，含有以下试剂：含有2×ExTaq的PCR反应液12.5uL、权利要求1所述的上游引物P-for和下游引物P-rev各0.5uL、权利要求1所述的上游引物C-for和下游引物C-rev各0.5uL、待测DNA模板1uL、ddH2O9.5uL，其中各引物的浓度均为0.2uM。其中，优选方案如下：该试剂盒中还含有以ddH2O为模板的空白对照。该试剂盒的PCR扩增反应的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、55℃退火40s、72℃延伸1min，共35个循环；72℃充分延伸10min。本专利技术的优点在于：(1)不需要用到测序技术，花费时间和钱财相对少；(2)可以同时完成两种病原的检测，对于两种病原同时存在或者只存在一种的情况均能检测到；(3)通过电泳片段大小即可判断病原，直观迅速。附图说明图1是P-for和P-rev特异性检测电泳图；图中：泳道1：DL2000Marker；泳道2：NBRCNO.30800；泳道3：NBRCNO.33126；泳道4-9：HT201801、JS151205、RZ201902、LS201903、NBRCNO.100633、NBRCNO.33253；泳道10：Pythiumultimum；泳道11-13：Pythiumrecalcitrans、Pythiuminflatum、Pythiumoopapillum；泳道14：OLPDFS201901-1；泳道15-17：Pseudoalteromonascarrageenovora、Yangiapacifica、Bacillushwajinpoensis；泳道18：阴性对照。图2是C-for和C-rev特异性检测电泳图；图中：泳道1：DL2000Marker；泳道2-7：HT201801、JS151205、RZ201902、LS201903、NBRCNO.100633、NBRCNO.33253；泳道8：NBRCNO.30800；泳道9：NBRCNO.33126；泳道10：Pythiumultimum；11-13：Pythiumrecalcitrans、Pythiuminflatum、Pythiumoopapillum；泳道14：OLPDFS201901-1；泳道15-17：Pseudoalteromonascarrageenovora、Yangiapacifica、Bacillushwajinpoensis；泳道18：阴性对照。图3是P-for和P-rev灵敏度检测电泳图；图中：泳道1：DL2000Marker；泳道2-9：拷贝数为107-100的标准质粒；泳道10：阴性对照。图4是C-for和C-rev灵敏度检测电泳图；图中：泳道1：DL2000Marker；泳道2-9：拷贝数为107-100的标准质粒；泳道10：阴性对照。图5是以标准质粒为模板的二重检测扩增产物检测电泳图；图中：泳道1：DL2000Marker；泳道2-12：检测Pythiumporphyrae引物对和检测Pythiumchondricola引物对的摩尔比分别为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1；泳道13：阴性对照。图6是检测Pythiumporphyrae引物对和检测Pythiumchondricola引物对摩尔比设定为1：1进行PCR扩增产物检测电泳图；图中：泳道1：DL2000Marker；泳道2、3：以Pythiumporphyrae和Pythiumchondricola两种菌DNA为模板；泳道4：阴性对照。图7是以P-for、P-rev和C-for、C-rev为引物的二重PCR特异性检测电泳图；图中：泳道1：DL2000Marker；泳道2：二重阳性对照；泳道3：以P-for、P-rev为引物的阳性对照；泳道4：以C-for、C-rev为引物的阳性对照；泳道5本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于紫菜赤腐病检测的两重PCR引物组，其特征在于，该引物组包含两组引物对，分别是检测Pythiumporphyrae引物对和检测Pythium chondricola引物对，所述检测Pythiumporphyrae引物对包括SEQ ID NO：1所示的上游引物P-for和SEQ ID NO：2所示的下游引物P-rev，所述检测Pythium chondricola引物对包括SEQ ID NO：3所示的上游引物C-for和SEQ ID NO：4所示的下游引物C-rev。/n
【技术特征摘要】
1.一种用于紫菜赤腐病检测的两重PCR引物组，其特征在于，该引物组包含两组引物对，分别是检测Pythiumporphyrae引物对和检测Pythiumchondricola引物对，所述检测Pythiumporphyrae引物对包括SEQIDNO：1所示的上游引物P-for和SEQIDNO：2所示的下游引物P-rev，所述检测Pythiumchondricola引物对包括SEQIDNO：3所示的上游引物C-for和SEQIDNO：4所示的下游引物C-rev。
2.根据权利要求1所述的一种用于紫菜赤腐病检测的两重PCR引物组，其特征在于，所述检测Pythiumporphyrae引物对和检测Pythiumchondricola引物对的摩尔比为1：1。
3.一种用于紫菜赤...
【专利技术属性】
技术研发人员：李杰，李贵阳，莫照兰，何礼娟，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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