用于检测阿达木单抗用药相关基因多态性的引物对及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种用于检测阿达木单抗用药相关基因多态性的引物对及试剂盒，属于体外核酸检测技术领域。所述引物对包括分别针对TNF rs1800629、KLRC1rs7301582、FCGR2A rs1801274、PTPRCrs10919563、HLA

【技术实现步骤摘要】
用于检测阿达木单抗用药相关基因多态性的引物对及试剂盒


[0001]本专利技术涉及体外核酸检测
，尤其涉及一种用于检测阿达木单抗用药相关基因多态性的引物对及试剂盒。

技术介绍

[0002]阿达木单抗(修美乐)先后在国家食品药品监督管理总局(CFDA)获批了3个适应症，分别是类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病。三种疾病存量患者都是500万人，共计1500万人。
[0003]类风湿关节炎(RA)是一种以对称性、多关节、小关节为主的慢性自身免疫性疾病，素有“不死癌症”之称，患病者的免疫系统会破坏健康关节，引发关节疼痛、肿胀、僵硬，产生疲劳和无力的症状，晚期可强直和畸形、功能严重受损，并最终导致关节功能丧失。修美乐与甲氨蝶呤合用，用于治疗对改善病情抗风湿药(DMARDs)，包括甲氨蝶呤疗效不佳的成年中重度活动性类风湿关节炎患者。修美乐与甲氨蝶呤联合用药，可以减缓患者关节损伤的进展(X线显示)，并且可以改善身体机能。与传统的药物相比，这类药物的疗效强且持久，能有效缓解疾病症状、影像学进展及功能水平，且安全性良好，适用于各种类风湿关节炎患者。
[0004]强直性脊柱炎(AS)是以骶髂关节和脊柱附着点炎症为主要症状的疾病。强直性脊柱炎是四肢大关节，以及椎间盘纤维环及其附近结缔组织纤维化和骨化，以及关节强直为病变特点的慢性炎性疾病。修美乐用于常规治疗效果不佳的成年重度活动性强直性脊柱炎患者。有起效快，疗效好的特点。大多数患者的病情可迅速获得显著改善，如晨僵、腰背痛、外周关节炎、肌腱末端炎、扩胸度、ESR和CRP等，应用一段时间后，患者的身体功能及健康相关生活质量明显提高，特别是可使一些新近出现的脊柱活动功能障碍得到恢复。
[0005]银屑病，是一种慢性、系统性、复发性、非传染性的自体免疫疾病，可累及多个系统。银屑病发病率逐年上升，是全球性的健康难题之一。广泛的临床研究和真实世界的证据显示，修美乐能快速清除皮损，并持续有效地改善银屑病症状，且具有公认的安全性。
[0006]自2002年上市至今，修美乐已经连续7年位居全球畅销药物榜首。其在全球拥有15个跨领域跨学科适应症，2018年全球销售额高达204.85亿美元，比第二名的阿哌沙班高出106亿美元。但是2018年在中国区战绩不足2亿元，相比于修美乐全球获批的15个适应症，其在中国也仅有类风湿关节炎、强直性脊柱炎及银屑病3个适应症获批，适应人群较小；修美乐由于没有进入医保，因此患者均以自费为主，价格过高。就以风湿性关节炎为例，患者1～2周注射一次，一年花费就高达20万元。随着国内药企阿达木单抗生物类药的报批，修美乐在各地开始“诚意”降价，最终降价59％，价格竞争力提高，药物可及性明显增强。
[0007]假设，国产阿达木单抗上市后进一步降价为4万元/年(降价80％)，医保支付后自费为2万元/年。存量患者渗透率即使只有1％，市场规模也高达＝1500万人*1％*4万元/年＝60亿元。存量患者渗透率如果达到5％，市场规模将高达300亿元。
[0008]近年来，药物基因组学研究发现，阿达木单抗与多个基因位点的多态性具有相关
性，如下表：
[0009][0010][0011]针对上表，本领域技术人员一般(不付出创造性劳动时)在做基因检测项目研发时会根据各自的实际需求选择具体的基因位点，如采用实时荧光定量PCR(QPCR)时，可能会选择PTPRC rs10919563这个位点(该位点循证等级高)，如采用二代测序平台时，可能选择上述位点同时检测(尽管目前还未发现有针对阿达木单抗上述所有相关位点的现有技术)。QPCR技术平台适用用于临床快速出检测报告(适用于阿达木单抗这类住院周期短的用药患者)，但是通量及检测灵敏度一般；二代测序平台适用于临床高通量长周期检测项目报告(适于肿瘤类长期住院患者)，但是不适于临床常规用药基因检测，尤其不适于阿达木单抗这类住院周期极短的用药患者，无论是经济性还是周期性都不能满足临床实际需求。
[0012]因此，本申请人采用ARMS PCR技术平台(ARMS也称作等位基因特异性PCR，Allele Specific PCR，AS
‑
PCR)，在检测灵敏度及成本方面均具有显著优势(目前用于基因检测的“金标准”是PCR直接测序法，但直接测序法的操作程序较复杂，敏感性不高，仅能检测出20
～30％以上的突变株等；相比于直接测序法，ARMS
‑
TaqMan法的灵敏性更高、成本更低。)。
[0013]另外，本申请人通过创造性的工作(通过查阅文献，整理各基因位点循证等级，整理各基因中国人群突变频率等数据，结合药物经济学因素)选择TNF rs1800629、KLRC1 rs7301582、FCGR2A rs1801274、PTPRC rs10919563、HLA
‑
E rs1264457、TRAF1 rs3761847和KLRD1 rs2302489这七个基因位点，以此确定中国风湿性疾病患者人群在进行阿达木单抗用药时，通过该组合基因位点的检测，更适宜中国患者人群(CHB+CHS)阿达木单抗的精准用药。
[0014]本试剂盒采用ARMS结合TaqMan荧光探针法：设计等位基因特异性PCR扩增引物，PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'～3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
[0015]在现有已公开报道的文献中，只有单独对TNF、KLRC1、FCGR2A、PTPRC、HLA
‑
E、TRAF1和KLRD1基因的分型检测(用途也并非针对阿达木单抗用药)，但单独应用时往往不能满足临床阿达木单抗用药相关基因分型的需求，需要对七个基因检测结合使用，在临床实践中存在诸多操作问题及体系交叉问题；
[0016]因此，将阿达木单抗用药相关七基因引物重新设计优化及对应PCR体系稳定性尚有较大的改进空间；我们在经过大量创意设计及实验筛选后，将上述七基因检测合而为一，优化了试剂盒的PCR反应体系，并显著改进了试剂盒产品性能。

技术实现思路

[0017]为了解决现有技术存在的技术问题，本专利技术提供一种检测结果准确、操作程序简单、敏感性高、特异性强、测序速度快并有效满足临床检验要求的检测阿达木单抗用药相关TNF rs1800629、KLRC1 rs7301582、FCGR2A rs1801274、PTPRC rs10919563、HLA
‑
E rs1264457、TRAF1 rs3761847和KLRD1 rs2302489基因多态性的引物对及试剂盒；采用ARMS结合QPCR技术来实现。
[0018]本专利技术提供一种用于检测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测阿达木单抗用药相关基因多态性的引物对，其特征在于，所述阿达木单抗用药相关基因检测的多态性位点分别为TNF rs1800629、KLRC1 rs7301582、FCGR2A rs1801274、PTPRC rs10919563、HLA
‑
Ers1264457、TRAF1 rs3761847和KLRD1rs2302489，所述引物对包括：针对TNF rs1800629等位基因的扩增引物，如下：扩增TNF rs1800629野生型和突变型通用下游引物和探针：下游引物，如SEQ ID NO：1所示，5
’‑
AAGCCCCTCCCAGTTCTAGTTC
‑3’
，探针，如SEQ ID NO：2所示5
’
CATGCCCCTCAAAACCTATTGCCTCC
‑3’
；扩增TNF rs1800629野生型上游引物，如SEQ ID NO：3所示：5
’‑
AGGCTGAACCCCGTGCT
‑3’
；扩增TNF rs1800629突变型上游引物，如SEQ ID NO：4所示：5
’‑
AGGCTGAACCCCGTGCC
‑3’
；针对KLRC1 rs7301582等位基因的扩增引物，如下：扩增KLRC1 rs7301582野生型和突变型通用下游引物和探针：下游引物，如SEQ ID NO：5所示，5
’‑
GTGATCAATCTGCATGACCAGATC
‑3’
，探针，如SEQ ID NO：6所示5
’
CAGATCACATCATGCCCGATAAAATTAGATAGCA
‑3’
；扩增KLRC1 rs7301582野生型上游引物，如SEQ ID NO：7所示：5
’‑
CCGGCCGATTGACTTAATACTG
‑3’
；扩增KLRC1 rs7301582突变型上游引物，如SEQ ID NO：8所示：5
’‑
CCGGCCGATTGACTTAATACTA
ꢀ‑3’
；针对KLRC1 rs7301582等位基因的扩增引物，如下：扩增FCGR2A rs1801274野生型和突变型通用下游引物和探针：下游引物，如SEQ ID NO：9所示，5
’‑
TGGACAGTGATGGTCACAGG
‑3’
，探针，如SEQ ID NO：10所示5
’
TTTGGATCCCACCTTCTCCATCCCAC
‑3’
；扩增FCGR2A rs1801274野生型上游引物，如SEQ ID NO：11所示：5
’‑
GAAAATCCCAGAAATTCTCGCG
‑3’
；扩增FCGR2A rs1801274突变型上游引物，如SEQ ID NO：12所示：5
’‑
GAAAATCCCAGAAATTCTCGCA
‑3’
；针对PTPRC rs10919563等位基因的扩增引物，如下：扩增PTPRC rs10919563野生型和突变型通用下游引物和探针：下游引物，如SEQ ID NO：13所示，5
’‑
AGCTGAGTCATGGGTATAAGGG
‑3’
，探针，如SEQ ID NO：14所示，5
’‑
TATATGCATTTTATAGCAATTACTATAATTATTTA
‑3’
；扩增PTPRC rs10919563野生型上游引物，如SEQ ID NO：15所示，5
’‑
CCATTATAAGGACATTCACGTTTCAC
‑3’
；扩增PTPRC rs10919563突变型上游引物，如SEQ ID NO：16所示，5
’‑
CCATTATAAGGACATTCACGTTTCAT
‑3’
；针对HLA
‑
Ers1264457等位基因的扩增引物，如下：扩增HLA
‑
Ers1264457野生型和突变型通用下游引物和探针：下游引物，如SEQ ID NO：17所示，5
’‑
GAGAGTCTCAGGCGCCTT
‑3’
，
探针，如SEQ ID NO：18所示5
’‑
TCGGGCCCCAGCTCGCAGCCAT
‑3’
；扩增HLA
‑
Ers1264457野生型上游引物，如SEQ ID NO：19所示：5
’‑
GCGGAGGAAGCGACC
‑3’
；扩增HLA
‑
Ers1264457突变型上游引物，如SEQ ID NO：20所示：5
’‑
GCGGAGGAAGCGACT
‑3’
；针对TRAF1 rs3761847等位基因的扩增引物，如下：扩增TRAF1 rs3761847野生型和突变型通用下游引物和探针：下游引物，如SEQ ID NO：21所示，5
’‑
GATGGCAATACCTGCTTCACAG
‑3’
，探针，如SEQ ID NO：22所示，5
’‑
CCTCAATACCACCCTCTCTACCTGCT
‑3’
；扩增TRAF1 rs3761847野生型上游引物，如SEQ ID NO：23所示，5
’‑
GTCCCTTCTCTCCCCTGCA
‑3’
；扩增TRAF1 rs3761847突变型上游引物，如SEQ ID NO：24所示，5
’‑
GTCCCTTCTCTCCCCTGCG
‑3’
；针对KLRD1 rs2302489等位基因的扩增引物，如下：扩增KLRD1 rs2302489野生型和突变型通用下游引物和探针：下游引物，如SEQ ID NO：25所示，5
’‑
GTAGAGAAGGCACGATGTGTAC
‑3’
，探针，如SEQ ID NO：26所示，5
’‑
TTTGCTAAATTTCTTCATACTCAACTTTCAGATTC
‑3’
；扩增KLRD1 rs2302489野生型上游引物，如SEQ ID NO：27所示，5
’‑
CATTTAAATACACAATTTTTCATTCTCGA
‑3’
；扩增KLRD1 rs2302489突变型上游引物，如SEQ ID NO：28所示，5
’‑
CATTTAAATACACAATTTTTCATTCTCGT
‑3’
；针对GAPDH内参基因的扩增引物，如下：扩增GAPDH基因的上游引物，如SEQ ID NO：29所示，5
’‑

【专利技术属性】
技术研发人员：滕祥云，廖敏，
申请(专利权)人：南昌豪仕医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：