原发性胆汁性胆管炎新的易感基因及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种原发性胆汁性胆管炎的新突变SNP位点，其特征在于，所述新突变SNP位点为人PTK2B基因外显子24，NM_173174.2，c.1679C

【技术实现步骤摘要】
原发性胆汁性胆管炎新的易感基因及其应用


[0001]本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种原发性胆汁性胆管炎新的易感基因及其应用。

技术介绍

[0002]原发性胆汁性胆管炎(Primary biliary cholangitis,PBC)，又称原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis,PBC)，是好发于中年女性的一种慢性自身免疫性疾病，患病率在世界不同地区为20
‑
40/10万,中国患病率数据有限，中国南方为49.2/10万。
[0003]PBC是主要以肝内小胆管的慢性非化脓性炎症为特征的自身免疫病，临床主要为胆汁淤积和肝功能减退的表现如黄疸、瘙痒、乏力等，血清学有碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、γ
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谷氨酰转肽酶(γ
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glutamyl transpeptidase,GGT)升高，多有抗线粒体抗体(Anti
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mitochondrial antibody,AMA)阳性。病理表现为肝内小胆管非化脓性肉芽肿性慢性炎症。
[0004]该病目前病因不明，较公认的观点是遗传因素及环境因素共同作用所致。有研究发现，PBC患者一级亲属PBC发生率高于正常人群约100倍，姐妹患病的相对风险为10左右，同卵双胞胎中同病一致率为63％，且发病年龄相似，而在异卵双生胎中没有共同发病。以上，均提示遗传因素在PBC中起重要作用。近年来随着第二代DNA测序技术(Next generation sequencing,NGS)的发展，加速和改变了对遗传性疾病的研究模式，提高了疾病研究效率。在不同种族的PBC人群中筛查到了不同的易感基因位点，如欧洲PBC患者中的易感基因为IL12A，IL12RB2，CD80，STAT4，CXCR5等，日本PBC患者中的易感基因为TNFSF15和POU2AF1，而在中国汉族PBC人群中，通过对14个SNPs检测显示存在易感基因TNFSF15和CD80，但并未发现POU2AF1和IL12A等易感基因，提示中国汉族PBC患者与欧洲、日本人群存在某些共同的易感基因，但同时又有自己不同的遗传易感性特征。
[0005]全外显子测序(Whole exome sequencing,WES)技术是以人类基因组中蛋白质编码序列为目的序列的第二代测序技术，外显子组(Exome)仅占不到人类整个基因组的1％，但在已知的人类单基因遗传病中，位于外显子区域的致病突变基因占绝大多数，该技术快速、高效、性价比高，被Science杂志评为2010年十大科学突破之一。散发PBC人群的NGS结果均显示PBC存在遗传易感性，而针对PBC的家族聚集现象，目前国际上尚无通过全外显子测序筛查中国汉族PBC家系易感基因的研究，因此，拟针对PBC患者家系进行全外显子测序，以筛查易感基因，更好的阐释该病的遗传学特征。
[0006]现有研究认为原发性胆汁性胆管炎是一种由于遗传因素和环境因素共同作用导致的疾病，而该病的一级亲属发病率远远高于普通人群，提示遗传因素在发病中起着重要作用。在现有的全基因组关联分析研究中，报道了原发性胆汁性胆管炎散发患者的相关易感基因，但目前尚没有关于中国汉族人群原发性胆汁性胆管炎患者家系易感基因的报道，且前期全基因组关联分析研究报道的相关易感基因后续暂未有关于基因功能进一步的动物实验。此外，目前该病尚没有非常好的动物模型。

技术实现思路

[0007]为解决上述问题，本专利技术提供一种原发性胆汁性胆管炎的新突变SNP位点。
[0008]本专利技术提供的一种原发性胆汁性胆管炎的新突变SNP位点为人PTK2B基因外显子24，NM_173174.2，c.1679C
→
G，p.560，Pro(P)
→
Arg(R)。
[0009]本专利技术还提供一种用于鉴定所述的原发性胆汁性胆管炎的新突变SNP位点的引物对，引物序列如下：
[0010]引物
‑
F：ACAGTGTAGGCAACAGCACAGAAG(SEQ ID No.2)
[0011]引物
‑
R：CGTGAAGCGTCGGAAGTTAATGGA(SEQ ID No.3)
[0012]本专利技术还提供一种用于鉴定所述的原发性胆汁性胆管炎的新突变SNP位点的试剂盒，其含有所述的引物对。任选地，所述试剂盒还可包括dNTPs、Taq酶、Mg
2+
和/或PCR反应缓冲液。
[0013]本专利技术还提供所述的新突变SNP位点在制备原发性胆汁性胆管炎检测、诊断、治疗和/或预后产品中的应用。
[0014]其中，所述产品为试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增基因PTK2B外显子24新突变SNP位点的引物对。
[0015]其中，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.2
‑
3所示。任选地，所述试剂盒还可包括dNTPs、Taq酶、Mg
2+
和/或PCR反应缓冲液。
[0016]PCR反应体系(25μl)：
[0017][0018]PCR循环反应条件：98℃变性2分钟；98℃10秒，60℃30秒，72℃30秒，共35个循环；72℃延伸7分钟。
[0019]对于疑诊原发性胆汁性胆管炎的患者，但抗线粒体抗体(AMA)、抗sp100、抗gp210等抗体检测呈阴性无法明确诊断，可通过抽取外周血2
‑
4ml进行该基因突变位点检测，若检测到C
→
G点突变，则为疾病诊断更进一步增加了证据。检测的引物和PCR反应体系和程序如前所述。
[0020]本专利技术还提供一种原发性胆汁性胆管炎的动物模型的构建方法，其包括如下步骤：
[0021]1)设计PTK2b基因19号外显子靶向的sgRNA识别序列，构建sgRNA；
[0022]2)设计构建有PTK2B
‑
P560R片段的供体质粒；
[0023]3)将Cas9 mRNA，sgRNA和供体共注射到小鼠受精卵，受精卵在交配后0.5天被移植到ICR雌性小鼠的输卵管中，移植后的19
‑
21天F0代小鼠出生；
[0024]4)将携带有PTK2B基因点突变的F0代小鼠和C57BL/6J回交以得到杂合突变小鼠；
[0025]5)将携带有PTK2B基因点突变的F1代雌雄小鼠进行繁育，得到携带基因突变的后
代小鼠。
[0026]其中，sgRNA的序列如SEQ ID No.4
‑
5所示。
[0027]本专利技术发现一个原发性胆汁性胆管炎患者新的易感基因，为疾病诊断新增了一个新的标志物，由于该病早期常无明显症状，待患者血清学指标(碱性磷酸酶、γ
‑
谷氨酰转肽酶、胆红素)有明显升高时往往已进入疾病中晚期，严重影响预后，因此新的标志物有助于实现疾病早期诊断，以早期治疗，从而改善患者预后。
[0028]本专利技术成功建本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种原发性胆汁性胆管炎的新突变SNP位点，其特征在于，所述新突变SNP位点为人PTK2B基因外显子24，NM_173174.2，c.1679C
→
G，p.560,Pro(P)
→
Arg(R)。2.一种用于鉴定权利要求1所述的原发性胆汁性胆管炎的新突变SNP位点的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.2
‑
3所示。3.一种用于鉴定权利要求1所述的原发性胆汁性胆管炎的新突变SNP位点的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的引物对。4.如权利要求1所述的新突变SNP位点在制备原发性胆汁性胆管炎检测、诊断、治疗和/或预后产品中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增权利要求1所述的新突变SNP位点的引物对。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.2
‑
3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张奉春，张学，边赛男，陈志磊，陈华，费允云，王立，刘素英，贺成美，杨岩磊，彭琳一，杨云娇，杨华夏，
申请(专利权)人：中国医学科学院北京协和医院，
类型：发明
国别省市：