基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，采用水热法制备Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子，ATP和T4 PNK存在时，滚环扩增反应引物链S1的5

【技术实现步骤摘要】
基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法


[0001]本专利技术涉及生化分析
，具体涉及一种基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法。

技术介绍

[0002]T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase,T4 PNK)是一种由噬菌体的pseT基因编码的一种蛋白质，具有5'激酶活性，可催化核酸5'羟基末端进行磷酸化，与DNA重组、复制以及损伤修复等正常细胞活动息息相关。此外，T4 PNK还是一种重要的分子生物学工具，T4 PNK的发现和应用在一定程度上促进了分子生物学的发展。目前，T4 PNK已经成为基因工程和生物分析研究中一种不可或缺的工具酶，并且进一步用于核酸损伤修复和酶抑制剂的研究。因此，测定T4 PNK的活性在生物化学及分子生物学领域都有重要意义。
[0003]磁性纳米粒子同时具有纳米材料性质和磁学特性。四氧化三铁Fe3O4磁性纳米粒子具有超顺磁性、比表面积大、优异的吸附性能、低毒性及表面原子配位不足等特点，常作为一些复合材料的载体或磁核用于富集分离本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)设计寡核苷酸序列；(2)制备Fe3O4磁性纳米粒子；(3)制备Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子：(4)制备二茂铁标记的核酸链S3(Fc
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S3)；(5)构建电化学生物传感器：在ATP和T4 PNK存在下，滚环扩增反应引物链S1的5
′
端磷酸化后与TiO2特异性反应，连接到Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面；加入环形模板S2，在T4 DNA连接酶存在下，核酸链S2与Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面引物链S1杂交形成环形混合物；在phi29 DNA聚合酶和dNTP存在下，Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面发生RCA反应，加入二茂铁标记的核酸链S3(Fc
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S3)，Fc
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S3与RCA反应产物杂交，被修饰到磁性纳米粒子表面；(6)测定T4多核苷酸激酶活性：以磁性金电极(GME)为工作电极，通过GME的磁性富集和电化学响应信号增强，实现对T4 PNK活性的定量测定。2.根据权利要求1所述的基于磁性纳米材料和生物信号放大技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的引物链S1具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述的核酸链S2具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述的核酸链S3具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；在步骤(2)中，水热法制备制备Fe3O4磁性纳米粒子：将FeCl3溶解于乙二醇，加入NaAc和聚乙二醇，搅拌溶液30分钟，然后转移至聚四氟乙烯高压釜中，200℃反应8小时后冷却至室温，用乙醇洗涤数次，磁力分离，室温下干燥，制得Fe3O4磁性纳米粒子；在步骤(3)中，制备Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子：将冰醋酸和钛酸丁酯溶于乙醇中，加入Fe3O4纳米粒子，超声分散15min，再加入聚乙二醇和尿素，搅拌1小时，然后将混合物转移到反应容器中，180℃下反应8小时，过滤沉淀物并用乙醇洗涤数次，80℃干燥12小时，制得Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子；在步骤(4)中，制备二茂铁标记的核酸链S3(Fc
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S3)：将二茂铁甲酸溶于PBS缓冲溶液，加入EDC和NHS，37℃下反应15min，加入β
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巯基乙醇；将上述混合液与核酸链S3等体积混合，37℃培养2h，制得Fc
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S3；在步骤(5)中，构建电化学生物传感器：在Tris
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HCl缓冲溶液(含引物链S1和ATP)中加入不同浓度的T4 PNK，37℃培育2h；加入Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子溶液，培育2小时；加入S2连接酶缓冲溶液(含T4 DNA连接酶)，37℃培育1h；加入RCA反应溶液，含phi29 DNA聚合酶和dNTP，37℃培育1h；加入Fc
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S3，37℃培育30min；将上述反应混...

【专利技术属性】
技术研发人员：张艳丽，刘在琼，庞鹏飞，王红斌，
申请(专利权)人：云南民族大学，
类型：发明
国别省市：