一种重组人干扰素-κ包涵体的纯化和复性方法技术

本发明专利技术公开了一种重组人干扰素

【技术实现步骤摘要】
一种重组人干扰素
‑
κ
包涵体的纯化和复性方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种重组人干扰素
‑
κ包涵体的柱层析复性方法。

技术介绍

[0002]干扰素(Interferon，IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用的细胞因子，其可以通过结合靶细胞上的同源受体复合物而发挥抗病毒的活性。其中，I型干扰素家族的多位成员，作为抗病毒药物候选，已经完成临床的药物试验，如重组IFN
‑
α2被应用于抗乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染的治疗药物，IFN
‑
β被应用于治疗多发性硬化症(MS)。对重症急性呼吸综合征急性期患者联合使用激素与IFN
‑
α治疗，可缩短患者的住院时间，促进肺部病变的吸收，减少对激素的需求量，但不会缩短发热持续时间，而且IFN
‑
α治疗可能与机体持续的炎症反应相关，不利于患者的恢复。
[0003]干扰素卡帕(Interferon
‑
κ，IFN
‑
κ)是近年来发现的一个新的IFN成员，IFN
‑
κ由207个氨基酸残基组成，包括N端27个氨基酸残基的信号肽，与Ⅰ型IFN的其他成员有约30％的同源性，IFN
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员比其他Ⅰ型IFN稍大，在C和D螺旋间有12个氨基酸残基的插入。IFN
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κ与IFN
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α、IFN
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β共同使用一个受体蛋白，属于I型干扰素。目前，已有研究发现编码IFN
‑
κ的基因选择性地在上皮角蛋白细胞中表达，重组hIFN
‑
κ与其他同型的干扰素类似，可以保护细胞免于病毒的感染；且所述表达具有种族的特异性。
[0004]IFN
‑
κ能够活化干扰素刺激基因，抑制脑心肌炎病毒(ECMV)和人类乳头瘤病毒(HPV)的复制。IFN
‑
κ是一种相对温和的I型干扰素，能有效抑制囊膜病毒的复制，是构成性表达的干扰素成员之一，组成抗病毒的天然免疫屏障，呼吸道给药无明显毒性，能够有效抑制流感病毒PR8、H9N2和H7N9以及寨卡病毒的复制，在降低病毒致病性中发挥重要保护作用，与IFN
‑
α相似，其作用机制主要是通过上调干扰素刺激基因以抑制病毒复制。
[0005]目前，对于IFN
‑
κ蛋白的研究相对较少，且从人体中获得IFN
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κ蛋白的量远远不能满足科研或临床应用的要求。因此，如何获得高纯度和高收率的IFN
‑
κ蛋白是当前迫切需要解决的问题。在现有技术中，利用大肠杆菌为宿主菌高效表达外源基因，形成包涵体，然后对包涵体复性是一种常用的方法。然而，包涵体蛋白的复性是当前一个重要的难题。传统的复性方法采用稀释、透析等常规操作，或者采用低浓度变性剂(盐酸胍或者尿素)洗涤，造成了洗涤过程中包涵体损失较大，产生大量废水，耗时耗能，且IFN
‑
κ蛋白的活性和收率都不高，不利于大规模生产。
[0006]因此，针对现有技术中存在的IFN
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κ蛋白复性过程存在的问题，提出了本专利技术。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种新的重组人干扰素
‑
κ包涵体的复性方法，其通过采用含有密码子优化的序列的基因工程菌株，将包涵体的溶解、纯化和复性步骤有机结合，实现了高的包涵体纯度和目标蛋白收率，且包涵体复性后获得具有优异的抗病毒活性的hIFN
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κ。
[0008]本专利技术的目的通过包括以下的技术方案来实现：
[0009]本专利技术的第一个方面，提供一种在原核生物细胞中高效表达的编码hIFN
‑
κ的基因，所述编码hIFN
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κ的基因具有：1)编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；2)与SEQ ID NO:2具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性，且能够编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；3)在SEQ ID NO:2序列基础上插入、缺失/添加一个或多个核苷酸残基，且能够编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或4)如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
[0010]本专利技术的第二个方面，提供一种核酸构建体，所述的核酸构建体包含可以在原核生物细胞中高效表达的编码hIFN
‑
κ的基因，所述编码hIFN
‑
κ的基因如本专利技术的第一个方面所述。
[0011]在另外的一个具体实施例中，所述的核酸构建体是可介导基因表达的载体。优选地，所述的载体为质粒载体或病毒载体；更优选地，所述的载体为质粒载体；更优选地，所述质粒选自但不限于pET30a、pCZN1、pET22b和pET28a中的任意一种。
[0012]本专利技术的第三个方面，提供核酸构建体的制备方法。具体的，所述的核酸构建体如本专利技术第二个方面所述；在一个具体的实施例中，所述的核酸构建体是将编码hIFN
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κ的编码基因插入到可诱导基因表达的表达框中。优选地，所述的基因是通过PCR的方法获得，所述的插入是通过酶切连接的方式进行；更优选地，所述的核酸构建体为质粒，优选为pET30a。
[0013]本专利技术的第四个方面，提供一种基因工程修饰的宿主细胞，所述的宿主细胞包含核酸构建体，所述的核酸构建体包含可以在原核生物中进行高效表达的编码hIFN
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κ的基因，所述的编码hIFN
‑
κ的基因如本专利技术的第一个方面所述；在一个具体的实施例中，载体为质粒载体或病毒载体；更优选地，所述的载体为质粒载体；更优选地，所述质粒选自但不限于pET30a、pCZN1、pET22b和pET28a中的任意一种。在另外的一个具体实施例中，所述的宿主细胞为原核生物细胞，优选为细菌细胞，更优选为枯草芽孢杆菌或大肠杆菌细胞；最优先为大肠杆菌BL21(DE3)细胞。在另外的一个具体实施例中，所述宿主细胞为真核生物细胞，优选为植物细胞、动物细胞、真菌细胞，更优选为酵母细胞。
[0014]本专利技术的第五个方面，提供如上所述的宿主细胞的制备方法，在一个具体的实施例中，所述的宿主细胞是通过转染(真核细胞)、转导(病毒载体)或转化(原核细胞)的方式将含有能够编码hIFN
–
κ的核苷酸序列的核酸构建体导入宿主细胞而获得；优选地，所述的转化为电转化；更优选地，所述的转化为热激转化。
[0015]本专利技术的第六个方面，提供一种重组人干扰素kappa(hIFN
‑
κ)包涵体的复性方法，包括如下步骤：
[0016]a)包涵体的获得：培养宿主细胞，诱导表达后收集菌体、重悬缓冲液重悬、破碎细胞后离心收集沉淀；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组人干扰素kappa(hIFN
‑
κ)包涵体的纯化和复性方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：a)包涵体的获得：培养宿主细胞，诱导表达后收集菌体、重悬缓冲液重悬、破碎细胞后离心收集沉淀；b)包涵体的洗涤：利用洗涤缓冲液重悬沉淀，均质2～3次，离心收集洗涤后的包涵体；c)包涵体的纯化：利用变性缓冲液溶解步骤b)获得的包涵体，离子交换层析得到包含纯化包涵体的洗脱液；d)包涵体的复性：将步骤c)获得的包含纯化包涵体的洗脱液加入到复性缓冲液中复性。2.如权利要求1所述的纯化和复性方法，其特征在于，所述步骤a)的包涵体通过培养含有编码hIFN
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κ的基因的宿主细胞后，诱导剂诱导表达、离心收集菌体、高压均质破碎细胞、离心收集获得；其中，所述编码hIFN
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κ的基因具有经过适应于宿主细胞密码子优化的序列；优选地，所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞；更优选地，所述的宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)细胞。3.如权利要求2所述的纯化和复性方法，其特征在于，所述编码hIFN
‑
κ的基因具有：1)编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；2)与SEQ ID NO:2具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性，且能够编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；3)在SEQ ID NO:2序列基础上插入、缺失/添加一个或多个核苷酸残基，且能够编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或4)如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。4.如权利要求2或3所述的纯化和复性方法，其特征在于，在步骤a)中，所述诱导表达包括在培养温度35～38℃、转速200～250rpm条件下培养宿主细胞，当OD600值达到10～20时用IPTG诱导，形成包涵体；优选地，所述IPTG的浓度为0.4
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1.2mM；更优选地所述IPTG的浓度为0.6
‑
1.0mM。5.如权利要求1
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3中任一项所述的复性方法，其特征在于，在步骤c)中，将溶解后的包涵体进行阳离子交换层析得到阳离子交换层析产物，将所述阳离子交换层析产物进行阴离子交换层析得到阴离子交换层析产物，其中变性缓冲液为：10
‑
50mM Tris，6
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10M尿素，50
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150mM NaCl，1
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2mM EDTA，1
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【专利技术属性】
技术研发人员：彭继先，李振森，晁香君，吴桂苹，韩景花，
申请(专利权)人：山东晶辉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：