婴幼儿配方食品中游离生物素含量的检测方法组成比例

本发明专利技术公开了一种婴幼儿配方食品中游离生物素含量的检测方法，包括以下步骤：标准溶液的配置；接种液的制备；试样的处理；待测液的制备；灭菌；接种；培养；分析测试。本发明专利技术优化了生物素标准溶液的配制方法，使得到的标准曲线的线性更好，降低了标准曲线的制备难度；同时对生物素测定用培养液的葡萄糖、尿素用量进行了优化，使菌株在培养和检测过程中基本不会受到碳源与氮源基质浓度限制，同时保证初始用量不会对菌株的生长产生明显抑制作用，从而提高了生物素线性范围内菌株最大生长量，使检测过程误差相对缩小，提高了检测的精确度。优化后该方法具有更好的重现性，灵敏度、简化了实验步骤，减少了检测时间和降低了检测成本。减少了检测时间和降低了检测成本。

【技术实现步骤摘要】
婴幼儿配方食品中游离生物素含量的检测方法


[0001]本专利技术涉微生物食品检测
，尤其涉及一种婴幼儿配方食品中游离生物素含量的检测方法。

技术介绍

[0002]生物素又称为维生素H,属于B族维生素，是含硫的一种维生素。生物素是乳制品重要的营养物质之一，这种维生素参与机体的三大营养代谢，是生物体生长发育必需的一种营养素，它参与有机体多种主要的新陈代谢活动。特别是对婴幼儿及孕产妇有着特殊的重要性，因此在婴幼儿乳制品、孕产妇乳制品及食品营养强化剂中添加生物素是十分必要的。生物素的主要用途有：构成视沉细胞内感光物质、维持上皮组织结构的完整和健全、增强机体免疫反应和抵抗力和维持正常生长发育。
[0003]近年来，随着生物素的发展越来越受到关注，检测的方法也越来越多，但每种检测方法的原理、时效、以及针对的产品都各不相同，故在实际应用上，能针对样品的不同而选择合适的生物素检测方法也是至关重要的。常用的生物素检测方法有很多，主要包括微生物法、高效液相色谱法、酶联免疫法、荧光法等。其中微生物的方法是目前应用比较广泛的方法，也是婴幼儿食品和乳品中游离生物素国标检测方法中唯一的检测方法，这个方法主要用于检测样品中生物素含量较低以及成分较复杂的情况。
[0004]但微生物法实际操作时总会遇到不少问题，例如测试管培养后吸光值不成梯度或测试菌不生长，测试样浓度不落在标准曲线范围内，接种液的配制操作复杂、微生物交叉污染等，再加上菌种活化周期长、样品处理过程繁琐等显著加大了生物素的检测误差。针对此类问题，本专利技术意在提供一种婴幼儿配方食品中游离生物素含量的检测方法，该方法对菌种活化、菌悬液制备、标准溶液配制以及样品处理等方面进行了优化，以提高试验质量和检测结果准确性，降低检测成本。

技术实现思路

[0005]为了解决上述问题，本专利技术第一方面提供了一种婴幼儿配方食品中游离生物素含量的检测方法，包括以下步骤：
[0006]S1，标准溶液的配置，称取一定量的生物素标准品用乙醇溶液定容成不同浓度的标准溶液；
[0007]S2，接种液的制备，将储备菌株直接接种到乳酸杆菌肉汤中36
±
1℃培养16
‑
20h，得到活化菌种；将活化菌种进行离心，弃去上清液；加入氯化钠溶液，混匀后再次离心，弃去上清液，重复前述操作2～3次，然后再加入一定量的氯化钠溶液稀释，得接种液；
[0008]S3，试样的处理，将粉状试样进行研磨、过筛；液体试样用前混合均匀；
[0009]S4，待测液的制备，所述待测液包括标准系列管和试样系列管；
[0010]S5，灭菌，将S4中所有的试管盖上试管帽，放入灭菌釜内灭菌；
[0011]S6，接种，在无菌操作条件下，向S5中所有试管加入接种液，其中标准曲线管中未
接种空白和样品空白除外；
[0012]S7，培养，将步骤S6后的所有试管放入培养箱中，恒温培养18h～20h；
[0013]S8，分析测试，将培养好的试管用漩涡混匀器混匀，用厚度为1cm比色杯，于550nm处测试。
[0014]作为一种优选的技术方案，所述的婴幼儿配方食品中游离生物素含量的检测方法，具体步骤为：
[0015]S1，标准溶液的配制，准确称取生物素标准品101.41mg用乙醇溶液定容至1000ml，配制成浓度为101.41μg/ml的标准储备液；吸取1ml标准储备液用乙醇溶液定容至100mL，配制成浓度为1.0141μg/ml的标准中间液；吸取1ml标准中间液用乙醇溶液定容至100ml，配制成浓度为10.141ng/ml的标准工作液，临用前现配；吸取一定量的标准工作液用乙醇溶液将其稀释成0.20282ng/ml的高浓度标准溶液和0.10141ng/ml的低浓度标准溶液，临用前现配；
[0016]S2，接种液的制备，将菌种植物乳杆菌转接至乳酸杆菌琼脂培养基中，37℃
±
1℃恒温培养箱中培养20h～24h，取出后放入2℃～4℃冰箱中保存，作为储备菌株保存；将储备菌株接种到乳酸杆菌肉汤中36
±
1℃培养16
‑
20h，得到活化菌种；将活化菌种在2000r/min的条件下离心2
‑
3min，弃去上清液；加入1mL已灭菌NaCl溶液，混匀后再离心2
‑
3min，弃去上清液，重复前述操作2～3次，然后再加入氯化钠溶液稀释，得接种液；
[0017]S3，试样的处理，将粉状试样进行研磨、过筛；液体试样用前混合均匀；准确称量适量样品(约含生物素含量0.2μg～0.5μg)，倒入250ml锥形瓶中加入硫酸溶液100ml，80～100℃水解1～2h，冷却后用碱式碳酸盐溶液调节pH至4.5
±
0.2，转入到250ml容量瓶中，用水定容，混合均匀；用滤纸过滤后得滤液，弃去最初的几毫升，吸取滤液5ml，加入20ml水，用碱式碳酸盐溶液调pH为6.8
±
0.2，转至100mL容量瓶中，定容，得试样提取液；
[0018]S4，待测液的制备，所述待测液包括标准系列管和试样系列管；
[0019]标准系列管：取试管C1～C10分别加入液低浓度标准液0.0mL、0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL和高浓度标准液3.0mL、4.0mL、5.0mL，补水至5.00mL，加5.0ml生物素测定用培养液，混匀，每梯度做3个平行样；其中C1为未接种空白，C2为接种空白；
[0020]试样系列管：取试管D1～D5，分别加入1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL试样提取液，补水至5.0mL(D5管除外)，加入5.0mL生物素测定用培养液，混匀，每梯度做3个平行样，其中D5为样品空白管；
[0021]S5，灭菌，将S4中所有的试管盖上试管帽，放入灭菌釜内灭菌；
[0022]S6，接种，在无菌操作条件下，用移液枪向S5中所有试管加入50μL接种液，其中未接种空白管C1和样品空白管D5除外；
[0023]S7，培养，将步骤S6后的所有试管放入培养箱中，在36
±
1℃温度条件下恒温培养18h～20h；
[0024]S8，分析测试，将培养好的试管用漩涡混匀器混匀，用厚度为1cm比色杯，于550nm处，以接种空白管C2调节透光率为100％，然后依次测定标准系列管、试样系列管吸光值。
[0025]作为一种优选的技术方案，在步骤S1中，所述乙醇溶液的体积分数为20％。
[0026]作为一种优选的技术方案，在步骤S2中，所述接种液的吸光度为0.5～0.65。
[0027]作为一种优选的技术方案，在步骤S3中，过筛时筛板的孔径为0.3mm～0.5mm。
[0028]作为一种优选的技术方案，在步骤S4中，所述生物素测定用培养液的原料包括10.0g酪蛋白氨基酸、30.0g葡萄糖、16.0g尿素、1.6g天冬氨酸、0.8g丝氨酸、1.6g本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.婴幼儿配方食品中游离生物素含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，标准溶液的配置，称取一定量的生物素标准品用乙醇溶液定容成不同浓度的标准溶液；S2，接种液的制备，将储备菌株直接接种到乳酸杆菌肉汤中36
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1℃培养16
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20h，得到活化菌种；将活化菌种进行离心，弃去上清液；加入氯化钠溶液，混匀后再次离心，弃去上清液，重复前述操作2～3次，然后再加入一定量的氯化钠溶液稀释，得接种液；S3，试样的处理，将粉状试样进行研磨、过筛；液体试样用前混合均匀；S4，待测液的制备，所述待测液包括标准系列管和试样系列管；S5，灭菌，将S4中所有的试管盖上试管帽，放入灭菌釜内灭菌；S6，接种，在无菌操作条件下，向S5中所有试管加入接种液，其中标准曲线管中未接种空白和样品空白除外；S7，培养，将步骤S6后的所有试管放入培养箱中，恒温培养18h～20h；S8，分析测试，将培养好的试管用漩涡混匀器混匀，用厚度为1cm比色杯，于550nm处测试。2.根据权利要求1所述的婴幼儿配方食品中游离生物素含量的检测方法，其特征在于，具体步骤为：S1，标准溶液的配置，准确称取生物素标准品101.41mg用乙醇溶液定容至1000ml，配制成浓度为101.41μg/ml的标准储备液；吸取1ml标准储备液用乙醇溶液定容至100mL，配制成浓度为1.0141μg/ml的标准中间液；吸取1ml标准中间液用乙醇溶液定容至100ml，配制成浓度为10.141ng/ml的标准工作液，临用前现配；吸取一定量的标准工作液用乙醇溶液将其稀释成0.20282ng/ml的高浓度标准溶液和0.10141ng/ml的低浓度标准溶液，临用前现配；S2，接种液的制备，将菌种植物乳杆菌转接至乳酸杆菌琼脂培养基中，37℃
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1℃恒温培养箱中培养20h～24h，取出后放入2℃～4℃冰箱中保存，作为储备菌株保存；将储备菌株接种到乳酸杆菌肉汤中36
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1℃培养16
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20h，得到活化菌种；将活化菌种在2000r/min的条件下离心2
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3min，弃去上清液；加入1mL已灭菌NaCl溶液，混匀后再离心2
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3min，弃去上清液，重复前述操作2～3次，然后再加入氯化钠溶液稀释，得接种液；S3，试样的处理，将粉状试样进行研磨、过筛；液体试样用前混合均匀；准确称量适量样品，倒入250ml锥形瓶中加入硫酸溶液100ml，80～100℃水解1～2h，冷却后用碱式碳酸盐溶液调节pH至4.5
±
0.2，转入到250ml容量瓶中，用水定容，混合均匀；用滤纸过滤后得滤液，弃去最初的几毫升，吸取滤液5ml，加入20ml水，用碱式碳酸盐溶液调pH为6.8
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0.2，转至100mL容量瓶中，定容，得试样提取液；S4，待测液的制备，所述待测液包括标准系列管和试样系列管；标准系列管：取试管C1～C10分别加入液低浓度标准液0.0mL、0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴丽娟，姜士平，李明明，
申请(专利权)人：上海微谱检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：