一种变异率低的青蒿一次性成苗组织培养方法技术

本发明专利技术涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种变异率低的青蒿一次性成苗组织培养方法，取苗期嫩叶为外植体，采用一次性成苗途径及MS+1.0 mg/L 6

【技术实现步骤摘要】
mg/L 6
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BA+2.0 mg/L NAA激素配比，并添加200mg/L鼠尾草酸。
[0008]进一步地，包括如下步骤：S1、取苗期嫩叶为外植体，流水冲洗1 h后无菌滤纸吸干表面水分，置于无菌操作台内用70%酒精消毒10 s，无菌水清洗3遍，0.1%升汞消毒10 min，无菌水清洗5遍，再用无菌滤纸吸干表面水分别置于无菌培养皿中，备用；S2、将青蒿嫩叶接种在2.0 mg/kg NAA+1.0 mg/kg 6
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BA+添加200mg/L鼠尾草酸的MS培养基中，温度23.5～25.0 ℃，光照为2000
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2050 Lux，光照时间12 h/d的条件下培养至形成完整的再生苗。
[0009]进一步地，所述MS培养基含蔗糖3%，琼脂0.75%，pH值为5.8～5.9。
[0010]本专利技术培养方法的出愈率、出芽率和生根率分别达97.78%、56.67%、56.67%，可获得低变异率、高质量的再生苗，大大降低了组织培养再生苗变异发生率，完整保留了青蒿优质种质资源的品种特性。
附图说明
[0011]图1为部分变异株照片；a：种子苗正常株；b～d：组培苗变异株；e：变异株（上）与正常株（下）叶片；f：变异株（右）与正常株（左）茎秆。
[0012]图2为组织培养各阶段照片；A：出愈；B：出愈和芽分化并存；C：丛芽快速生长；D～E：生根；F：水培炼苗。
具体实施方式
[0013]下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。
实施例
[0014]材料供试材料选自湖南星辰科技所提供的母本原种（GH10），2018年10月和2019年2月分两批播种在种子发芽箱（韶关市泰宏医疗器械有效公司）内，采用高压灭菌锅（上海迅博实业有限公司）消毒后的基质（N+P2PO5+K2O＞15%）为苗床育苗，2018年11月取10月播种的幼苗上部幼嫩叶片（完全叶，有羽裂）进行组织培养（以下简称组培），所成再生苗与2019年2月播种的种子苗经炼苗后于2019年4月初移栽大田，每处理移栽100株，考察植株性状变异情况。2019年10月于再次播种（GH10），育苗同2018年，进行组培技术优化研究。
[0015]试验设计及考察项目1.2.1 组织培养再生苗的获得（1）青蒿外植体消毒：取1.1中幼嫩叶片，流水冲洗1 h后无菌滤纸吸干表面水分，置于无菌操作台内用70%酒精消毒10 s，无菌水清洗3遍，0.1%升汞消毒10 min，无菌水清洗5遍，再用无菌滤纸吸
干表面水分别置于无菌培养皿中备用。
[0016]（2）青蒿外植体一次性成苗途径（WA1）：将青蒿嫩叶（完整叶，不切段/片）接种在2.0 mg/kg NAA+1.0 mg/kg 6
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BA的MS培养基中， 30 d即可出愈，43 d形成颜色淡绿且致密度适中的愈伤组织块，48 d后开始逐渐分化，62 d部分生根，根量大，根长较长，至此形成完整的再生苗。
[0017]（3）外植体
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愈伤组织
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分化出芽
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生根成苗（WA2）：取接种后40 d愈伤组织块，无菌操作台内切成0.5 cm
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0.5 cm小块转接于0.5 mg/kg NAA+ 1.0 mg/kg 6
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BA的MS培养基中，18 d开始分化出丛状浓绿幼芽，25 d部分嫩芽茎伸长形成无根幼苗；30 d将分化出的幼苗转接于1.0 mg/kg NAA+0.5 mg/kg 6
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BA的MS培养基中，16 d开始生根，至25 d产生白色带根毛的不定根，至此形成完整的再生苗。
[0018]（4）种子播种后形成种子苗途径（WA0 ）：参照1.1。
[0019]上述的培养条件为：MS培养基含蔗糖3%，琼脂0.75%，pH值为5.8～5.9；温度23.5～25.0 ℃，光照为2000
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2050 Lux，光照时间12 h/d。
[0020]1.2.2 不同组培途径再生苗性状变异情况考察将1.1和1.2.1中获得WA1和WA2途径再生苗和WA0途径种子苗，于2018年4月5日移栽至肥力中等均匀的大田中，每种不同途径苗移栽3行，每行33～34株，株行距80 cm
×
60 cm共100株，完全随机分布，移栽后120 d观察三者株型、叶型、茎秆形态，详细记录变异情况并计算变异株率。现蕾前约20 d（8月15日）取样，紫外分光光度法初测青蒿素含量，后全株取样晾晒2 d后脱叶称重，折算单株产量。
[0021]1.2.3 组织培养植物生长调节剂优化以1.2.2研究结果为基础，以2019年播种GH10种子苗为材料，取羽裂嫩叶为外植体，对激素配比进行考察，试验设置如表1所示。每处理接种3
×
10瓶，每瓶3个外植体，3次重复。考察出愈时间、分化时间、出苗量和出苗质量。
[0022]1.2.4 外源添加剂选择以1.2.3的研究结果为基础，针对愈伤组织褐化和丛芽玻璃化现象，拟对不同外源添加剂种类和浓度进行探索，试验设置见表2，组织培养过程参照1.2.3，记录愈伤组织褐化数、褐化率，丛芽玻璃化数、玻璃化率。
[0023]数据统计与分析采用Excel2010进行数据统计；SPSS 22进行方差分析，S
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N
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K法进行方差齐性检验。
[0024]表1 MS培养基中不同植物生长调节剂配比设置
表2 MS培养基中不同抗褐化和玻璃化外源添加剂梯度设置2结果与分析2.1 不同组培途径再生苗性状变异情况植物表型与基因型和环境密切相关，相同栽培环境下，作物表型主要受遗传因子控制。青蒿由于其基因多态性，采用种子繁殖往往出现大量的自然变异株，而这种变异特性，在为青蒿育种提供丰富材料的同时，也严重制约着青蒿优势种质资源的保存。此外，植物采用组织培养获得再生苗的过程中，由于扩繁系数大，细胞分裂和染色体复制频繁，发生变异的几率也大大增加，而这种变异，在青蒿组织培养过程中尤为明显。
[0025]如表3所示，种子苗途径（WA0）由于其品系纯度高，大田未发现明显变异株。一次性成苗途径（WA1）中，WA1
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3、WA1
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16、WA1
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66三株单株出现明显变异，表现为株高变高，茎围变小，平均分枝夹角变小；叶色变深，叶片变大，叶型指数降低；茎秆扁化、颜色变深；青蒿素含量和单株产量降低。而经WA2途径变异率达7.00%，且变异方向多元化：相较对照WA0途径，青蒿单株WA2
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7、WA2
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13、WA2
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43、WA2
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59、WA2
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种变异率低的青蒿一次性成苗组织培养方法，其特征在于：采用一次性成苗途径及MS+1.0 mg/L 6
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BA+2.0 mg/L NAA激素配比，并添加200mg/L鼠尾草酸。2.如权利要求1所述的一种变异率低的青蒿一次性成苗组织培养方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、取苗期嫩叶为外植体，流水冲洗1 h后无菌滤纸吸干表面水分，置于无菌操作台内用70%酒精消毒10 s，无菌水清洗3遍，0.1%升汞消毒10 min，无菌水清洗5遍，再用无菌滤纸吸干表面水分别...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐利忠，朱旺冲，孙小成，欧阳国春，雷干农，蒋小军，谢宜芝，莫志军，
申请(专利权)人：永州市农业科学研究所，
类型：发明
国别省市：