用于生产具有改变的生物碱水平的烟草植物和制品的基于PMT工程改造的组合物和方法技术

本公开提供了与具有改变的总生物碱和尼古丁水平和商业上可接受的叶等级的烟草植物、它们通过育种或转基因方法的开发以及从这些烟草植物生产烟草制品有关的组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产具有改变的生物碱水平的烟草植物和制品的基于PMT工程改造的组合物和方法序列表的并入本申请要求2018年7月26日提交的美国临时申请第62/703,775号和2019年5月15日提交的美国临时申请第62/848,159号的权益，这两个申请通过引用以其整体并入本文。大小为200,338字节(在MS-中测量)且于2019年7月25日创建的名为“P34620WO00_SL.txt”的文件中所包含的序列表据此以电子方式提交，并通过引用以其整体并入。
本公开提供了用于调节生物碱和尼古丁水平的烟草基因工程。
技术介绍
尼古丁是主要的生物碱，通常占商业烟草栽培品种中的总生物碱的超过90-95％。剩余的生物碱级分主要包含三种另外的生物碱：去甲烟碱、假木贼碱和新烟草碱。通过调控不同的尼古丁生物合成基因和转录调节因子，已经实现了尼古丁水平降低的的烟草植物，具有不同且不一致的结果。需要降低烟叶中尼古丁平水的新技术。
技术实现思路
本公开提供了具有改变的总生物碱和尼古丁水平和商业上可接受的叶等级的烟草植物、它们通过育种或转基因方法的开发，以及从这些烟草植物生产烟草制品。在一个方面中，本公开提供了烟草植物或其部分，其在至少一个PMT基因中包含一个或多个突变体等位基因，所述至少一个PMT基因选自由PMT1a、PMT1b、PMT2、PMT3和PMT4组成的群组，其中当在相当的条件下生长和加工时，所述烟草植物能够产生尼古丁水平低于来自不具有所述一个或多个突变体等位基因的对照烟草植物的叶的尼古丁水平的叶。在另一个方面中，烟草植物在至少两个PMT基因中包含一个或多个突变体等位基因，所述至少两个PMT基因选自由PMT1a、PMT1b、PMT2、PMT3和PMT4组成的群组。在进一步的方面中，烟草植物在至少三个PMT基因中包含一个或多个突变体等位基因，所述至少三个PMT基因选自由PMT1a、PMT1b、PMT2、PMT3和PMT4组成的群组。在另一个方面中，烟草植物在至少四个PMT基因中包含一个或多个突变体等位基因，所述至少四个PMT基因选自由PMT1a、PMT1b、PMT2、PMT3和PMT4组成的群组。在进一步的方面中，烟草植物在五个PMT基因中包含一个或多个突变体等位基因，所述五个PMT基因选自由PMT1a、PMT1b、PMT2、PMT3和PMT4组成的群组。在一个方面中，本公开提供了选自由单pmt突变体、双pmt突变体、三突变体、四突变体和五突变体组成的群组的烟草植物，如表8A至8E中所列出的。在一个方面中，本公开提供了如表4A至4E或表10中列出的烟草植物。在另一个方面中，本公开提供了表4A至4E或表10中烟草植物的后代植物，其来自与表4A至4E或表10中另一种植物的自交或杂交。在另一个方面中，本公开提供了一种烟草植物，其包含表5A至5E或表12A至12E中列出的pmt突变体等位基因的各种组合，以产生单pmt突变体、双pmt突变体、三突变体、四突变体或五突变体。在一个方面中，本公开提供了包含pmt突变体等位基因序列的烟草植物，所述pmt突变体等位基因序列选自由SEQIDNos.21至200、410至441、474至505、538至569、602至633和666至697组成的群组。本公开进一步提供了调制烟草、叶组配方、包含来自所公开的烟草植物、品系、品种或杂交种的植物材料的烟草制品。序列的简要描述SEQIDNos：1至5分别阐述了来自TN90参考基因组的PMT1b、PMT1a、PMT2、PMT3和PMT4的示例性基因组序列。SEQIDNos：6至10分别阐述了来自TN90的PMT1b、PMT1a、PMT2、PMT3和PMT4的示例性cDNA序列。SEQIDNos：11至15分别阐述了来自TN90的PMT1b、PMT1a、PMT2、PMT3和PMT4的示例性多肽序列。SEQIDNos：16至22阐述了示例性的导引RNA序列。SEQIDNos：23至200、410至441、474至505、538至569、602至633和666至697阐述了示例性编辑的pmt突变序列。附图说明图1：图TN90根中五个PMT基因的RNA表达图2：各种低尼古丁品系：CS15(NLM(PhPh)背景中的五pmt敲除突变品系CS15，VA359背景中的PMTRNAi转基因品系)和低尼古丁KY171(“LNKY171”)品种(KY171背景含有nic1和nic2双突变)中的尼古丁水平，与其各自的正常生物碱对照系：NLM(PhPh)、VA359和KY171背景相比。图3：各种低生物碱品系：CS15、PMTRNAi和LNKY171中的总生物碱水平，与它们各自的正常生物碱对照品系：NLM(PhPh)、VA359和KY171背景相比较。图4：各种低生物碱品系：CS15、PMTRNAi和LNKY171中的叶片产量，与它们各自的正常生物碱对照品系：NLM(PhPh)、VA359和KY171背景相比较。图5：各种低生物碱品系：CS15、PMTRNAi和LNKY171中的叶片质量，与它们各自的正常生物碱对照品系：NLM(PhPh)、VA359和KY171背景相比较。图6：描绘调制烟草上霉菌生长的照片，包括TN90LC(图6A)、LABU21(图6B)、包含下调PR50的RNAi构建体的TN90(图6C)、包含下调PMT基因的RNAi构建体的TN90(图6D)和包含对所有五个PMT基因的编辑的TN90(图6E)。图7：在图6A-6E中检查的品系中观察到的霉菌感染的描述。具体实施方式除非另有定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。本领域技术人员将认识到在本公开的实践中可以使用许多方法。事实上，本公开绝不限于所描述的方法和材料。出于本公开的目的，以下术语定义如下。本文引用的任何参考文献(包括例如所有专利和公开)都通过引用以其整体并入。如本文所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括它们的混合物。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过将阐述的数值的上下边界扩大10％来修改该范围。如本文所使用的，短语诸如“小于”、“大于”、“至少”、“至多”、“大约”、“低于”、“高于”和“约”当与一系列数值结合使用时，修饰这一系列中的每个数值。例如，“小于1％、2％或3％”的表述相当于“小于1％、小于2％或小于3％”。如本文所使用的，烟草植物是指来自烟草属物种的植物。烟草中尼古丁的生物合成始于：使用S-腺苷-甲硫氨酸作为辅因子，将多胺(腐胺)通过酶(腐胺N-甲基转移酶(PMT))甲基化为N-甲基腐胺。这是使前体代谢物参与尼古丁生物合成的步骤。PMT酶在酶分类系统下归类为EC2.1.1.53。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种烟草植物或其部分，其在至少一个PMT基因中包含一个或多个突变体等位基因，所述至少一个PMT基因选自由PMT1a、PMT1b、PMT2、PMT3和PMT4组成的群组，其中当在相当的条件下生长和加工时，所述烟草植物能够产生尼古丁水平低于来自不具有所述一个或多个突变体等位基因的对照烟草植物的叶的尼古丁水平的叶。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180726 US 62/703,775;20190515 US 62/848,1591.一种烟草植物或其部分，其在至少一个PMT基因中包含一个或多个突变体等位基因，所述至少一个PMT基因选自由PMT1a、PMT1b、PMT2、PMT3和PMT4组成的群组，其中当在相当的条件下生长和加工时，所述烟草植物能够产生尼古丁水平低于来自不具有所述一个或多个突变体等位基因的对照烟草植物的叶的尼古丁水平的叶。


2.根据权利要求1所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物在至少两个PMT基因中包含一个或多个突变体等位基因，所述至少两个PMT基因选自由PMT1a、PMT1b、PMT2、PMT3和PMT4组成的群组。


3.根据权利要求1所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物在至少三个PMT基因中包含一个或多个突变体等位基因，所述至少三个PMT基因选自由PMT1a、PMT1b、PMT2、PMT3和PMT4组成的群组。


4.根据权利要求1所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物在至少四个PMT基因中包含一个或多个突变体等位基因，所述至少四个PMT基因选自由PMT1a、PMT1b、PMT2、PMT3和PMT4组成的群组。


5.根据权利要求1所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物在五个PMT基因中包含一个或多个突变体等位基因，所述五个PMT基因选自由PMT1a、PMT1b、PMT2、PMT3和PMT4组成的群组。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的烟草植物或其部分，其中当在相当的条件下生长和加工时，所述烟草植物能够产生尼古丁水平低于来自不具有所述一个或多个突变体等位基因的对照烟草植物的叶的尼古丁水平的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.25％的叶。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的烟草植物或其部分，其中当在相当的条件下生长和加工时，所述烟草植物能够产生总生物碱水平低于来自所述对照烟草植物的叶的总生物碱水平的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.25％的叶。


8.根据权利要求7所述的烟草植物或其部分，其中当在相当的条件下生长和加工时，所述烟草植物能够产生总生物碱水平小于来自所述对照烟草植物的叶的总生物碱水平的40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％的叶。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述一个或多个突变体等位基因包含序列区域中的突变，所述序列区域选自由启动子、5’UTR、第一外显子、第一内含子、第二外显子、第二内含子、第三外显子、3’UTR、终止子及其任意组合组成的群组。


10.根据权利要求1至9中任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述一个或多个突变体等位基因包含一种或多种突变类型，所述突变类型选自由无义突变、错义突变、移码突变、剪接位点突变及其任意组合组成的群组。


11.根据权利要求1至10中任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述一个或多个突变体等位基因导致以下中的一种或多种：PMT蛋白截短、不可翻译的PMT基因转录物、非功能性PMT蛋白、PMT基因中的过早终止密码子及其任意组合。


12.根据权利要求1至11中任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述一个或多个突变体等位基因包含突变，所述突变选自由相对于野生型PMT基因的一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入、重复和倒位组成的群组。


13.根据权利要求1至12中任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述一个或多个突变体等位基因包括合子状态，所述合子状态选自由纯合的、杂合的和杂等位基因组成的群组。


14.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·库迪西普迪，亓栋，沈燕新，U·瓦雷克，J·斯特里克兰德，许冬梅，
申请(专利权)人：奥驰亚客户服务有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US