水稻细胞分裂素氧化酶基因OsCKX4的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种利用水稻细胞分裂素氧化酶基因

【技术实现步骤摘要】
水稻细胞分裂素氧化酶基因OsCKX4的应用
本专利技术涉及一种水稻细胞分裂素氧化酶基因OsCKX4的应用，属于植物基因工程

技术介绍
水稻是我国最重要的粮食作物之一，年种植面积超过4亿亩，承担了约60％人口的口粮。随着可耕地面积和淡水资源日趋紧张以及人口的持续增加，我国粮食需求不断增长。自2010年起，我国水稻进出口发生逆转，成为水稻净输入国，保障粮食安全面临着严峻挑战(程式华和方福平,2019)。在水稻生产中，每穗粒数是水稻产量的重要构成要素。因此，在水稻中研究控制穗粒数的相关基因及其应用，对水稻产量的遗传改良实践具有重要意义。植物激素是植物体内产生的一些微量且能调节(促进、抑制)自身生理过程的有机化合物。生长素与细胞分裂素被发现在穗分支发育中发挥重要的调控作用。生长素在腋生分生组织起始时大量积累，在原基生长时消耗，而下一个原基形成的部位形成一个新的生长素积累(Gallavottietal.,2008)。因此，生长素被认为是水稻腋生分生组织起始以及二次枝梗特化所必需的(MockaitisandEstelle,2008；McSteen,2009)。LAX1在水稻生殖发育过程中调控侧生分生组织的形成(Komatsuetal.,2001；Komatsuetal.,2003a)。LAX1和其玉米中同源基因BARRENSTALK1(BA1)在花序发育过程中能够调节生长素的合成或运输(Gallavottietal.,2008；OikawaandKyozuka,2009)。LAX2是水稻中另一个决定腋生分生组织起始的调控因子，能与LAX1相互作用(Tabuchietal.,2011)。突变体asp1的多种表型缺陷可能与多种参与分生组织功能的基因被激活有关，asp1腋芽的生长重新激活且叶序发生改变，提示该基因可能与生长素行为紧密相关(Yoshidaetal.,2012)。细胞分裂素(cytokinin,CTK)在农业生产上应用广泛，能促进细胞分裂与膨大、促进侧生分支形成及生长、促进花芽座果及物质的调运和积累。细胞分裂素氧化酶(cytokininoxidase,CKX)是CTK代谢途径的关键酶，通过改变内源CTK水平调节植物生长发育及器官形成(Galuszkaetal.,2000)。转玉米ZmCKX1基因显著降低花芽CTK水平，导致小花不育和结实率降低，外施CTK可恢复育性(Huangetal.,2003)。水稻细胞分裂素氧化酶家族共有11个家族成员，依次为OsCKX1-11，部分成员功能已经被报道。OsCKX2基因表达量下调导致水稻分蘖、穗粒数以及粒重增加，显著提高了水稻产量。过表达OsCKX4基因导致突变体细胞分裂素水平降低，根长明显变长且冠根数量增多。OsCKX9基因能够被独脚金内酯诱导表达，进而调控细胞分裂素水平，该基因功能缺失突变体呈现分蘖增多、株高变矮、穗子减小的表型。其它水稻细胞分裂素氧化酶功能还未被阐明。水稻细胞分裂素氧化酶家族11个成员中，只有OsCKX2被报道与穗粒调控相关，其他10个成员的功能或未被解析或与穗粒数调控无关，绝大部分OsCKX功能未被报道。因此，解决上述问题迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种水稻细胞分裂素氧化酶基因OsCKX4的应用，利用反义抑制的技术策略，构建反义抑制载体，将OsCKX4导入到受体品种中花11，为培育高产新品种提供思路。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种利用水稻细胞分裂素氧化酶基因OsCKX4调节水稻每穗粒数的方法，以特异启动子驱动，降低所述基因OsCKX4的表达水平，控制水稻每穗粒数。进一步地，所述基因OsCKX4的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。进一步地，所述特异启动子为LOG基因启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。进一步地，具体包括：通过PCR的方法扩增LOG基因启动子区以及OsCKX4编码区，产物回收后通过同源重组连入载体pCAMBIA1300；将LOG启动子区1.7kb和OsCKX4的编码区全长克隆到上述载体中；将重组载体转化农杆菌菌株EHA105，然后采用农杆菌介导的转化方法，转化受体材料中花11胚性愈伤组织。进一步地，扩增LOG基因启动子区采用引物的核苷酸序列为：PLOGF1：AATTCGAGCTCGGTACCGAGGTTATCGTCTCCCTGCGPLOGR1：AAAATTGCTTGCCACCCGTC。进一步地，扩增OsCKX4编码区采用引物的核苷酸序列为：ckx4F1：GACGGGTGGCAAGCAATTTTCAAGGACATAGGTAGTGATckx4R1：CATGCCTGCAGGTCGACATGCGGGGAGCCATGAAGCCG。本专利技术提供了水稻细胞分裂素氧化酶基因OsCKX4在调节水稻每穗粒数中的应用。本专利技术所达到的有益效果：本专利技术利用反义抑制的技术策略，构建反义抑制载体，将OsCKX4导入到受体品种中花11，在中花11背景中反义抑制OsCKX4的表达，可以显著降低其转录水平，并增加穗粒数，其他主要农艺性状并未受影响。本专利技术首次提出了利用调节OsCKX4表达水平来增加穗粒数，对水稻的产量性状改良具有重要意义。附图说明图1是对照材料ZH11与两个反义抑制转化材料proLOG::aCKX4-2与proLOG::aCKX4-3中OsCKX4基因的表达水平；图2是对照材料ZH11与两个反义抑制转化材料proLOG::aCKX4-2与proLOG::aCKX4-3的成株期表现及单株产量直观图；图3是对照材料ZH11与两个反义抑制转化材料proLOG::aCKX4-2与proLOG::aCKX4-3的穗部形态直观图；图4是对照材料ZH11与两个反义抑制转化材料proLOG::aCKX4-2与proLOG::aCKX4-3穗粒数对比图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。实施例1水稻(OryzasativaL.)材料粳稻品种ZH11是中国水稻研究所自有品种。通过PCR的方法扩增LOG基因启动子区以及OsCKX4编码区，包括以下步骤：1.DNA提取取约1cm长的水稻叶片置于研钵中；加入800μl1.5×CTAB，研磨叶片至匀浆并倒回1.5mL离心管内；65℃水浴20-30min，每5min中颠倒混匀一次；加入等体积的24:1(氯仿/异戊醇)，上下颠倒混匀，持续10min；10，000rpm离心，10min；吸取400上清液至新的离心管，加入2倍体积经冰镇的95％乙醇，-20℃冰镇20min；12，000rpm离心，15min；弃上清，加入500μl75％乙醇，12，000rpm离心5min；弃上清，置于超净台吹干或自然晾干，加80μlddH2O溶解备用。2.RNA提本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用水稻细胞分裂素氧化酶基因OsCKX4调节水稻每穗粒数的方法，其特征在于，以特异启动子驱动，降低所述基因OsCKX4的表达水平，增加水稻每穗粒数。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用水稻细胞分裂素氧化酶基因OsCKX4调节水稻每穗粒数的方法，其特征在于，以特异启动子驱动，降低所述基因OsCKX4的表达水平，增加水稻每穗粒数。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因OsCKX4的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特异启动子为LOG基因启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括：
通过PCR的方法扩增LOG基因启动子区以及OsCKX4编码区，产物回收后通过同源重组连入载体pCAMBIA1300；
将LOG启动子区1.7kb和OsCKX4的编码区全长克隆到上述载体中；
将重组载体转化农杆菌菌株EHA1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张健，王惠梅，王以锋，童晓红，应杰政，
申请(专利权)人：中国水稻研究所，
类型：发明
国别省市：浙江;33