一种栾树遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种栾树遗传转化方法，包括:(1)栾树外植体的准备；(2)栾树愈伤组织快速诱导；(3)农杆菌菌液侵染和共培养；(4)愈伤组织脱菌、筛选培养；(5)不定芽分化培养；(6)生根培养。该栾树遗传转化方法，从栾树种子萌发获得无菌苗，以各组织部位诱导的愈伤组织为受体，以GFP基因为报告基因通过脓杆菌介导的方法进行遗传转化，利用潮霉素抗性位点梯度筛选阳性转化受体愈伤组织，以愈伤组织分化培育发育成完整植株，实现植物再生，建立起高效快速的栾树遗传转化体系。

【技术实现步骤摘要】
一种栾树遗传转化方法
本专利技术涉及栾树遗传转化和组培
，具体涉及一种可利用栾树愈伤组织为受体的农杆菌介导，潮霉素(Cef)梯度筛选阳性转化愈伤组织的遗传转化方法，其中还包含了栾树无菌苗快速获得以及愈伤组织诱导、分化、生根所需的高效培养基配比等系列完整的栾树遗传转化方法。
技术介绍
栾树属无患子科栾树属植物，生长于石灰石风化产生的钙基土壤中，该植物耐盐渍、干旱及短期洪水，具有较深的根系，对环境具有很强的适应性。这些特征使栾树成为了我国南方重金属污染区植物修复的重要先锋树种，另外，栾树荫蔽力强，抗风能力强，对粉尘、二氧化硫和臭氧具有较强的抗性和治理作用。同时，栾树也具有良好的经济效应，其木材成黄白色，易加工，能用于一些木材类器具的制造与加工，叶可作为蓝色染料的来源，花可供药用，种子可以榨制工业用油。由此可见，选育出生长快速且繁育力高，可用于不同经济生产型或环境治理型栾树优株和无性系对栾树产业化生产与实际应用具有重要意义。然而众所周知木本植物生长周期长、树体高大，且由于长期异交具有高度的杂合性，因此，传统育种并不能适应速生树木遗传改良本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种栾树遗传转化方法，其特征在于，依次包括以下步骤：/n(1)栾树外植体的准备；/n(2)栾树愈伤组织快速诱导；/n(3)农杆菌菌液侵染和共培养；/n(4)愈伤组织脱菌、筛选培养；/n(5)不定芽分化培养；/n(6)生根培养。/n

【技术特征摘要】
1.一种栾树遗传转化方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
(1)栾树外植体的准备；
(2)栾树愈伤组织快速诱导；
(3)农杆菌菌液侵染和共培养；
(4)愈伤组织脱菌、筛选培养；
(5)不定芽分化培养；
(6)生根培养。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的栾树外植体采用以下任一种方式获得：
1)将栾树种子浓硫酸浸泡，然后用碳酸氢钠溶液清洗中和、浸泡，消毒处理后进行促萌发培养，其中栾树种子促萌发固体培养基为DKW基本培养基，附加：琼脂粉4-5g/L，6BA，1.5-2.0mg/L，NAA，0.2-0.4mg/L，GA3，0.4-0.6mg/L，结冷胶1.0-1.5g/L；
2)选取休眠状芽的茎段，冲洗干净，切成带有1-2个芽的茎段，消毒处理，无菌水冲洗获得无菌外植体，将无菌外植体转移至培养基中使其生长；
将步骤1)或者步骤2)萌发后的栾树幼苗切割茎段与根系，诱导愈伤组织。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)的栾树外植体采用以下任一种方式获得：
1)将过6目筛的栾树种子进行65％-75％浓硫酸浸泡3-4分钟后，50-60g/L的碳酸氢钠溶液反复清洗种子彻底中和浓硫酸，再利用50-60g/L的碳酸氢钠水溶液浸泡种子10-12min，然后对种子进行消毒处理：70％乙醇40-50s，0.1％升汞2-10min，无菌水冲洗三次以上获得无菌种子，消毒处理后进行促萌发培养，其中栾树种子促萌发固体培养基为DKW基本培养基，附加：6BA，2.0mg/L，NAA，0.4mg/L，GA3，0.4mg/L，结冷胶1.2g/L；浓硫酸为70％的浓硫酸，升汞处理时间为7-8min；
2)选取休眠状芽的茎段，浸泡12h以上，流水冲洗3h以上，切成带有1-2个芽的茎段长0.5-1cm，消毒处理：70％乙醇35-45s，0.1％升汞7-10min，无菌水冲洗三次以上获得无菌外植体，将无菌外植体转移至培养基中使其生长至5-8cm；
将步骤1)或者步骤2)萌发后的栾树幼苗切割，其中茎段或根系切割为0.5-1cm，诱导愈伤组织。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤(2)栾树愈伤组织快速诱导具体包括：
将外植体在愈伤组织快速培养基上进行诱导，栾树愈伤组织快速诱导培养基配方为1/2MS基础培养基，附加：琼脂粉，4-5g/L，结冷胶，1.0-1.5g/L，6BA，2.0mg/L，IBA，0.2-0.25mg/L，2.4D，0.5-1.0mg/L，NAA，0.5mg/L，PVP，500mg/L，椰汁，10％-15％；优选为琼脂粉，4g/L，结冷胶，1.2g/L，6BA，2.0mg/L，IBA，0.25mg/L，2.4D，1.0mg/L，NAA，0.5mg/L，PVP，500mg/L，椰汁，10％。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤(3)农杆菌菌液侵染和共培养包括以下步骤：
1)介导农杆菌菌液制备；
2)侵染和共培养
挑取愈伤组织，转入含农杆菌悬浮液中浸泡侵染，吸干多余菌液，将愈伤组织嵌入固体共培养基上，21-23℃暗培养2-3d。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
共培养使用的固体培养基配方为：MS培养基，附加6-BA,0.5-1.0mg/L，IBA,0.05-0.1mg/L，TDZ,0.5mg/L，As，20-25mg/L,琼脂粉，4-5g/L，结冷胶，1.0-1.5g/L,pH5.6-5.8；优选为6-BA，1.0mg/L，IBA0.1mg/L，TDZ，0.5mg/L，As20mg/L，琼...

【专利技术属性】
技术研发人员：王平，周韬，白磊，何其浩，孙吉康，
申请(专利权)人：中南林业科技大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43