一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法技术

本发明专利技术提供了一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，属于棉花育种技术领域。海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，设计合成GhNSP基因的sgRNA1和sgRNA2；将sgRNA1和sgRNA2串联构建到CRISPR/Cas9基因编辑载体中；将构建的载体在农杆菌介导下转入陆地棉，筛选获得转基因材料和海岛棉进行杂交，对杂交后代进行Hi‑Tom检测，筛选含CRISPR/Cas9与sgRNA的T‑DNA片段的杂交后代，得到海岛棉杂交后代雄性不育材料。本发明专利技术提供的方法简单、高效创制出海岛棉杂交后代雄性不育材料，为海岛棉材料的遗传改良提供新思路，同时对海岛棉材料的基因功能验证具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法
本专利技术属于棉花育种
，具体涉及一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法。
技术介绍
棉花作为重要的经济作物和油料作物，具有重要的经济价值，在我国乃至世界的国民经济发展中占据重要地位。其在植物学分类上属于锦葵科(Malvaceae)棉属(Gossypium)。在长期的栽培与驯化过程中，棉花共形成了四个栽培种，包括两个二倍体栽培种：草棉(G.herbaceum)、亚洲棉(G.arboreum)，和两个四倍体栽培种：陆地棉(G.hirsutum)、海岛棉(G.barbadense)。陆地棉产量约占世界棉花总产量的90％，海岛棉约占5～8％(Qinetal.,2011)。海岛棉纤维品质优良，对棉花黄萎病具有较高的耐病性，但产量相对较低，这很大程度上限制了海岛棉品种的生产实践过程。通过遗传突变的方法来改良海岛棉的生产特性，有利于提高海岛棉的种植价值。CRISPR/Cas9技术的简单高效，目前已经广泛的应用于作物的遗传改良中。在棉花中，利用CRISPR/Cas9技术创制突变体材料需要经过组织培养过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)设计合成GhNSP基因的sgRNA1和sgRNA2；/n2)将sgRNA1和sgRNA2串联构建到CRISPR/Cas9基因编辑载体中；/n3)将步骤2)构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体在农杆菌的介导下转化陆地棉材料，筛选获得陆地棉突变体材料；/n4)将所述陆地棉突变体材料和海岛棉进行杂交，对杂交后代进行Hi-Tom检测，筛选含CRISPR/Cas9与sgRNA的T-DNA片段、敲除GhNSP基因的杂交后代，得到海岛棉杂交后代雄性不育材料。/n

【技术特征摘要】
1.一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)设计合成GhNSP基因的sgRNA1和sgRNA2；
2)将sgRNA1和sgRNA2串联构建到CRISPR/Cas9基因编辑载体中；
3)将步骤2)构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体在农杆菌的介导下转化陆地棉材料，筛选获得陆地棉突变体材料；
4)将所述陆地棉突变体材料和海岛棉进行杂交，对杂交后代进行Hi-Tom检测，筛选含CRISPR/Cas9与sgRNA的T-DNA片段、敲除GhNSP基因的杂交后代，得到海岛棉杂交后代雄性不育材料。


2.根据权利要求1所述海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，其特征在于，步骤1)中所述sgRNA1的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；
所述sgRNA2的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。


3.根据权利要求1所述海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，其特征在于，步骤2)中sgRNA1和sgRNA2串联构建到CRISPR/Cas9基因编辑载体的方法，包括以下步骤：
A.以pGTR载体为模板，分别扩增含所述sgRNA1的目标片段1和含所述sgRNA2的目标片段2；
B.将所述含所述sgRNA1的目标片段1和含所述sgRNA2的目标片段2利用重叠延伸PCR方法连接形成串联有sgRNA1和sgRNA2的长片段；
C.将所述串联有sgRNA1和sgRNA2的长片段插入pRGEB32-GhU6.7-NPTII载体中，得到含sgRNA1和sgRNA2的CRISPR/Cas9基因编辑载体。


4.根据权利要求3所述海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，其特征在于，步骤A中所述扩增含所述sgRNA1的目标片段1用引物对为inf-pRGER32-7-S和GhNSP-CRISPR-1-AS；
所述inf-pRGER32-7-S的核苷酸序列如SEQIDNO：...

【专利技术属性】
技术研发人员：闵玲，张献龙，吴元龙，金双侠，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42