一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法技术

本发明专利技术提供了一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，属于棉花育种技术领域。海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，设计合成GhNSP基因的sgRNA1和sgRNA2；将sgRNA1和sgRNA2串联构建到CRISPR/Cas9基因编辑载体中；将构建的载体在农杆菌介导下转入陆地棉，筛选获得转基因材料和海岛棉进行杂交，对杂交后代进行Hi‑Tom检测，筛选含CRISPR/Cas9与sgRNA的T‑DNA片段的杂交后代，得到海岛棉杂交后代雄性不育材料。本发明专利技术提供的方法简单、高效创制出海岛棉杂交后代雄性不育材料，为海岛棉材料的遗传改良提供新思路，同时对海岛棉材料的基因功能验证具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法
本专利技术属于棉花育种
，具体涉及一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法。
技术介绍
棉花作为重要的经济作物和油料作物，具有重要的经济价值，在我国乃至世界的国民经济发展中占据重要地位。其在植物学分类上属于锦葵科(Malvaceae)棉属(Gossypium)。在长期的栽培与驯化过程中，棉花共形成了四个栽培种，包括两个二倍体栽培种：草棉(G.herbaceum)、亚洲棉(G.arboreum)，和两个四倍体栽培种：陆地棉(G.hirsutum)、海岛棉(G.barbadense)。陆地棉产量约占世界棉花总产量的90％，海岛棉约占5～8％(Qinetal.,2011)。海岛棉纤维品质优良，对棉花黄萎病具有较高的耐病性，但产量相对较低，这很大程度上限制了海岛棉品种的生产实践过程。通过遗传突变的方法来改良海岛棉的生产特性，有利于提高海岛棉的种植价值。CRISPR/Cas9技术的简单高效，目前已经广泛的应用于作物的遗传改良中。在棉花中，利用CRISPR/Cas9技术创制突变体材料需要经过组织培养过程。而棉花组织培养再生过程，受到基因型影响，只有个别品种能够进行组织培养再生获得植株，且目前还未有海岛棉再生成功的报道，因此无法直接通过转基因再生技术获得突变体材料，这就大大的限制了CRISPR/Cas9技术在棉花遗传改良上的应用，特别是在海岛棉中的应用。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，是利用陆地棉转基因雄性不育突变体材料与海岛棉材料进行杂交，以获得在海岛棉材料中相应的雄性不育的突变体材料，实现海岛棉的遗传改良目的。本专利技术提供了一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，包括以下步骤：1)设计合成GhNSP基因的sgRNA1和sgRNA2；2)将sgRNA1和sgRNA2串联构建到CRISPR/Cas9基因编辑载体中；3)将步骤2)构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体在农杆菌的介导下转化陆地棉材料，筛选获得陆地棉突变体材料；4)将所述陆地棉突变体材料和海岛棉进行杂交，对杂交后代进行Hi-Tom检测，筛选含CRISPR/Cas9与sgRNA的T-DNA片段、敲除GhNSP基因的杂交后代。优选的，步骤1)中所述sgRNA1的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述sgRNA2的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。优选的，步骤2)中sgRNA1和sgRNA2串联构建到CRISPR/Cas9基因编辑载体的方法，包括以下步骤：A.以pGTR载体为模板，分别扩增含所述sgRNA1的目标片段1和含所述sgRNA2的目标片段2；B.将所述含所述sgRNA1的目标片段1和含所述sgRNA2的目标片段2利用重叠延伸PCR方法连接形成串联有sgRNA1和sgRNA2的长片段；C.将所述串联有sgRNA1和sgRNA2的长片段插入pRGEB32-GhU6.7-NPTII载体中，得到含sgRNA1和sgRNA2的CRISPR/Cas9基因编辑载体。优选的，步骤A中所述扩增含所述sgRNA1的目标片段1用引物对为inf-pRGER32-7-S和GhNSP-CRISPR-1-AS；所述inf-pRGER32-7-S的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；所述GhNSP-CRISPR-1-AS的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。优选的，步骤A中所述扩增含所述sgRNA2的目标片段2用引物对为GhNSP-CRISPR-2-S和GhNSP-CRISPR-2-AS；所述GhNSP-CRISPR-2-S的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；所述GhNSP-CRISPR-2-AS的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示。优选的，所述重叠延伸PCR方法中所用的引物为核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的inf-pRGER32-7-S和核苷酸序列如SEQIDNO：7所示的infGhNSP-CRISPR-AS。优选的，所述陆地棉材料包括Jin668。优选的，所述筛选含CRISPR/Cas9和sgRNA的T-DNA片段的方法是利用gRNA1-Hi-Tom-gb-S和gRNA1-Hi-Tom-AS引物对检测gRNA1，用gRNA2-Hi-Tom-gb-S和gRNA2-Hi-Tom-AS引物对检测gRNA2；gRNA1-Hi-Tom-gb-S的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；gRNA1-Hi-Tom-AS的核苷酸序列如SEQIDNO：9所示；gRNA2-Hi-Tom-gb-S的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；gRNA2-Hi-Tom-AS的核苷酸序列如SEQIDNO：11所示。优选的，所述海岛棉包括新海35号。本专利技术提供了一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，本专利技术通过在可以进行遗传转化的陆地棉材料中对棉花隐性核不育恢复基因GhNSP进行基因编辑敲除，创制陆地棉突变体材料，再通过杂交将含CRISPR/Cas9与sgRNA的T-DNA片段转移到海岛棉中，获得杂交后代中发生GhNSP基因的敲除，获得雄性不育性状。本专利技术提供的创制方法对海岛棉材料的遗传改良与基因功能验证具有非常重要的意义。附图说明图1为本专利技术中用于创造基因编辑棉花材料的pRGEB32-GhU6.7-NPT2-GhNSP质粒载体图谱，其中，左下角sgRNA功能元件已用圆角方框标出，LBT-DNArepeat和RBT-DNArepeat中间的片段为插入到基因组中的T-DNA片段；图2为利用GhNSP-CRISPR/Cas9系统在陆地棉中获得不育系材料；其中A为转化受体材料Jin668植株形态图；B为转化pRGEB32-GhU6.7-NPTII-GhNSP的植株形态图；C为Jin668材料与转基因植株T0代花药的表型图，左边为Jin668花药图表现为正常开裂，右边为转基因材料花药图表现花丝变短，花药不能正常开裂的败育表型；D为Jin668材料花粉碘碘化钾染色结果，花粉被染成黑色，表示为花粉发育正常可育；E为转基因材料花粉碘碘化钾染色结果，花粉无法被染成黑色，表示为花粉发育异常不育；图3为杂交后代检测T-DNA片段的电泳图；图4为利用GhNSP-CRISPR/Cas9系统在海岛棉中突变GhNSP的同源基因Gbar_D02G025630与Gbar_D04G020900，创制海岛棉不育系材料，在后代群体材料中筛选获得不育系材料；A为杂交后代表型鉴定结果；B和C为Hi-TOM鉴定基因型结果，其中A的比例尺为2cm。具体实施方式本专利技术提供了一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，包括以下步骤：1)设计合成GhNSP基因的sgRNA1和sgRNA2；2)将sgRNA1和sgRNA2串联构建到CRISPR/Cas9基因编辑载体中；3)将步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)设计合成GhNSP基因的sgRNA1和sgRNA2；/n2)将sgRNA1和sgRNA2串联构建到CRISPR/Cas9基因编辑载体中；/n3)将步骤2)构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体在农杆菌的介导下转化陆地棉材料，筛选获得陆地棉突变体材料；/n4)将所述陆地棉突变体材料和海岛棉进行杂交，对杂交后代进行Hi-Tom检测，筛选含CRISPR/Cas9与sgRNA的T-DNA片段、敲除GhNSP基因的杂交后代，得到海岛棉杂交后代雄性不育材料。/n

【技术特征摘要】
1.一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)设计合成GhNSP基因的sgRNA1和sgRNA2；
2)将sgRNA1和sgRNA2串联构建到CRISPR/Cas9基因编辑载体中；
3)将步骤2)构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体在农杆菌的介导下转化陆地棉材料，筛选获得陆地棉突变体材料；
4)将所述陆地棉突变体材料和海岛棉进行杂交，对杂交后代进行Hi-Tom检测，筛选含CRISPR/Cas9与sgRNA的T-DNA片段、敲除GhNSP基因的杂交后代，得到海岛棉杂交后代雄性不育材料。


2.根据权利要求1所述海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，其特征在于，步骤1)中所述sgRNA1的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；
所述sgRNA2的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。


3.根据权利要求1所述海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，其特征在于，步骤2)中sgRNA1和sgRNA2串联构建到CRISPR/Cas9基因编辑载体的方法，包括以下步骤：
A.以pGTR载体为模板，分别扩增含所述sgRNA1的目标片段1和含所述sgRNA2的目标片段2；
B.将所述含所述sgRNA1的目标片段1和含所述sgRNA2的目标片段2利用重叠延伸PCR方法连接形成串联有sgRNA1和sgRNA2的长片段；
C.将所述串联有sgRNA1和sgRNA2的长片段插入pRGEB32-GhU6.7-NPTII载体中，得到含sgRNA1和sgRNA2的CRISPR/Cas9基因编辑载体。


4.根据权利要求3所述海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，其特征在于，步骤A中所述扩增含所述sgRNA1的目标片段1用引物对为inf-pRGER32-7-S和GhNSP-CRISPR-1-AS；
所述inf-pRGER32-7-S的核苷酸序列如SEQIDNO：...

【专利技术属性】
技术研发人员：闵玲，张献龙，吴元龙，金双侠，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42