一种TMV侵染性克隆载体及其构建方法技术

本发明专利技术提供了一种TMV侵染性克隆载体及其构建方法，构建得到的TMV侵染性克隆载体为pCB‑TMV‑SY，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，长度为11275bp，可应用于研究TMV与寄主植物之间的相互作用、TMV功能基因组、TMV分子检测、抗TMV药剂药效检测等方面。本发明专利技术的有益之处在于：构建方法简便、新颖，克服了酶易失活等传统双酶切构建载体方法的缺陷，构建得到侵染性克隆载体只侵染植物，对动物、人体相对安全，为研究基因合成定点突变提供了条件，实现了载体在宿主中高效表达外源蛋白、高效侵染烟草和辣椒等植物的目的，可应用于药效机理研究和效能检测等多个方面。

【技术实现步骤摘要】
一种TMV侵染性克隆载体及其构建方法
本专利技术属于基因工程领域
，涉及植物病毒侵染性克隆载体构建技术，特别涉及是一种TMV侵染性克隆载体及其构建方法。
技术介绍
烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus)属于烟草花叶病毒属(genusTobamovirus)成员，TMV的基因组是单链的，编码至少4个开放阅读框(ORF)，包括126kDa和183kDa的复制酶蛋白，30kDa运动蛋白(MP)和17.5kDa外壳蛋白(CP)，该病毒寄主范围广，严重威胁着烟草，番茄，马铃薯等作物的生产，给农业生产造成了重大的经济损失。植物RNA病毒cDNA侵染性克隆已经作为植物RNA病毒分子实验研究中的一种常用技术。是植物RNA病毒反向遗传学研究的前提和基础，对cDNA侵染性克隆进行点突变，缺失突变或插入突变可以研究病毒的基因编码策略，研究其编码基因的功能，研究基因组上非编码序列对病毒基因组RNA复制和转录的调控等，现今对于植物正义RNA病毒的广泛研究正是得益于cDNA侵染性克隆的成功构建和应用。RNA病毒cDNA侵染性克隆还可以应用于表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种TMV侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：/n(1)病毒样品及序列的获得：首先，使用TRIzol试剂从TMV沈阳分离物(TMV-SY)侵染的新鲜烟叶中提取总RNA；其次，以所述总RNA作为模板进行反转录，得到cDNA；之后，以反转录得到的所述cDNA为模板，TMV+和TMV-为引物，使用Primestar GXL DNA聚合酶进行PCR扩增，得到长度为6395bp的DNA片段，即为TMV-SY片段，且所述TMV-SY片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；/n(2)二元载体pCB301的获得：以含有35S启动子的质粒pCB301作为模板，TMV3Rb+和...

【技术特征摘要】
1.一种TMV侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
(1)病毒样品及序列的获得：首先，使用TRIzol试剂从TMV沈阳分离物(TMV-SY)侵染的新鲜烟叶中提取总RNA；其次，以所述总RNA作为模板进行反转录，得到cDNA；之后，以反转录得到的所述cDNA为模板，TMV+和TMV-为引物，使用PrimestarGXLDNA聚合酶进行PCR扩增，得到长度为6395bp的DNA片段，即为TMV-SY片段，且所述TMV-SY片段的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
(2)二元载体pCB301的获得：以含有35S启动子的质粒pCB301作为模板，TMV3Rb+和TMV5-35S为引物进行PCR扩增，得到长度为4920bp的DNA片段，即为二元载体pCB301，且所述二元载体pCB301的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；
(3)TMV侵染性克隆载体pCB-TMV-SY的获得：使用连接试剂盒将所述TMV-SY片段和所述二元载体pCB301进行连接，即将所述TMV-SY片段插入所述二元载体pCB301的35S启动子和35S终止子之间，构建得到一种TMV侵染性克隆载体pCB-TMV-SY。


2.根据权利要求1所述一种TMV侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述反转录过程是利用M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒完成的。


3.根据权利要求1所述一种TMV侵染性克隆载...

【专利技术属性】
技术研发人员：安梦楠，夏子豪，张崇，吴元华，赵秀香，夏博，王志平，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21