产生病毒的方法和组合物技术

本发明专利技术涉及一种用于产生用作疫苗的重组腺病毒的方法，该重组腺病毒包含编码目的异源基因的核苷酸序列，该方法包括以下步骤：通过将末端蛋白复合腺病毒基因组DNA(TPC‑Ad gDNA)与多核苷酸重组，将异源目的基因插入腺病毒基因组，该多核苷酸包含编码目的基因的核苷酸序列，并所述核苷酸序列的5’末端和3’末端与在体外重组反应中腺病毒基因组DNA的插入位点序列同源；用来自(i)的体外重组反应混合物的稀释液转染在单个容器中生长的细胞，使得许多这样的单个容器包含被重组腺病毒感染的单个细胞，所述重组腺病毒包含编码目的异源基因的核苷酸序列；鉴定其中单个细胞已被重组腺病毒感染的那些个容器，所述重组腺病毒包含编码目的异源基因的核苷酸序列。适当地，所述TPC‑Ad gDNA包含血清型匹配的末端蛋白和腺病毒基因组，所述目的基因编码单个表位、表位串、抗原区段或完整抗原蛋白。本发明专利技术还涉及使用这些方法制备的重组腺病毒和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】产生病毒的方法和组合物
本专利技术涉及重组腺病毒的快速产生，用于诱导针对异源抗原的免疫应答，适当地为保护性免疫应答，所述异源抗原包括感染性病原体抗原和与癌症有关的肿瘤抗原。
技术介绍
源自血清5型人腺病毒(HAdV-C5)或其他人类腺病毒或猿猴腺病毒的复制能力不强的腺病毒载体已被用作疫苗载体，以在多个临床试验中传递感染性病原体抗原和癌症抗原(Eweretal.(2017)HumVaccinImmunother.13(12):3020-3032和Cappuccinietal.(2016)CancerImmunolImmunother.65(6):701-13.)。这些载体为疫苗开发提供了许多优势。它们在人中不具有复制能力，因此比复制载体更安全；它们感染复制和非复制细胞；它们具有广泛的组织嗜性，可引起高免疫反应，包括特别有效的细胞免疫；而且它们很容易纯化至高滴度(Morrisetal.(2016)FutureVirology11(9),649-659)。结合λ噬菌体Red重组(重组工程)的细菌人工染色体(BAC)技术的出现促进了腺病毒基因组的克隆和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于产生用作疫苗的重组腺病毒的方法，该重组腺病毒包含编码目的异源基因的核苷酸序列，该方法包括以下步骤：/n(i)通过将末端蛋白复合腺病毒基因组DNA(TPC-Ad gDNA)与多核苷酸重组，将异源目的基因插入腺病毒基因组，所述多核苷酸包含编码目的基因的核苷酸序列，并所述核苷酸序列的5’末端和3’末端与在体外重组反应中与腺病毒基因组DNA的插入位点序列同源；/n(ii)用来自(i)的体外重组反应混合物的稀释液转染在单个容器中生长的细胞，使得许多这样的单个容器包含被重组腺病毒感染的单个细胞，所述重组腺病毒包含编码目的异源基因的核苷酸序列；/n(iii)鉴定其中单个细胞已被重组腺病毒感染的那...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180830 GB 1814141.61.一种用于产生用作疫苗的重组腺病毒的方法，该重组腺病毒包含编码目的异源基因的核苷酸序列，该方法包括以下步骤：
(i)通过将末端蛋白复合腺病毒基因组DNA(TPC-AdgDNA)与多核苷酸重组，将异源目的基因插入腺病毒基因组，所述多核苷酸包含编码目的基因的核苷酸序列，并所述核苷酸序列的5’末端和3’末端与在体外重组反应中与腺病毒基因组DNA的插入位点序列同源；
(ii)用来自(i)的体外重组反应混合物的稀释液转染在单个容器中生长的细胞，使得许多这样的单个容器包含被重组腺病毒感染的单个细胞，所述重组腺病毒包含编码目的异源基因的核苷酸序列；
(iii)鉴定其中单个细胞已被重组腺病毒感染的那些个容器，所述重组腺病毒包含编码目的异源基因的核苷酸序列。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，TPC-AdgDNA包含血清型匹配的末端蛋白和腺病毒基因组。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，目的基因编码单个表位、表位串、抗原区段或完整抗原蛋白。


4.根据上述权利要求中任意一项所述的方法，其中，多核苷酸是合成的DNA分子，纯化的DNA限制片段或聚合酶链反应(PCR)产物。


5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述多核苷酸在其5’末端具有5至50bp之间的碱基，在其3’末端具有5至50bp之间的碱基，其与腺病毒基因组DNA的插入位点序列同源。


6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述多核苷酸在其5’末端具有10至20bp之间的碱基，在其3’末端具有10至20bp之间的碱基，其与所述腺病毒基因组DNA的插入位点序列同源。


7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述多核苷酸在其5’末端具有15bp的碱基，在其3’末端具有15bp的碱基，其与所述腺病毒基因组DNA的插入位点序列同源。


8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，腺病毒基因组DNA的插入位点序列位于E1基因座内。


9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，TPC-AdgDNA在腺病毒基因组DNA的插入位点序列内的独特的限制性位点处被消化，所述限制性位点在其5’端侧接长四环素调节的CMV启动子，所述启动子驱动目的基因的表达，并且所述限制性位点在其3’端侧接牛生长激素聚腺苷酸化序列。


10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，体外重组反应包含40ng消化的TPC-AdgDNA和44fmol编码目的基因的合成DNA的3’和5’末端。


11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在转染前一天将要转染的细胞以3.75×105细胞/ml的密度接种在单个容器中。


12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在单个容器中以约80％汇合生长的同时转染细胞。


13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，被转染的细胞稳定表达四环素阻遏物。


14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，将体外重组反应混合物在转染培养基中稀释并等分，以便转染在60个单独容器中生长的细胞。


15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，将转染的细胞冷冻并解冻以释放细胞相关病毒，并且使用来自每个孔的转染细胞的细胞裂解液、一组引物和探针通过定量PCR(qPCR)来鉴定重组腺病毒的存在，所述探针设计成与腺病毒反向末端重复序列(ITR)下游基因组和非编码区中目标基因插入位点的上游基因组的左端结合。


16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述腺病毒基因组源自猿猴腺病毒。


17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述猿猴腺病毒是ChAdOx...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·吉尔伯特，S·J·莫里斯，
申请(专利权)人：牛津大学科技创新有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB