一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测和分子分型方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种新型冠状病毒SARS‑CoV‑2检测和分子分型方法及试剂盒。该方法利用一步法多重RT‑PCR与HRM分析联用，同时实现SARS‑CoV‑2的检测和分型。本发明专利技术的检测方法，包括以下步骤：1)样本核酸提取；2)在专用引物组和试剂完成一步法多重RT‑PCR反应；3)HRM分析判读SARS‑CoV‑2检测结果和分子分型结果。本发明专利技术提供的试剂盒，包含有多重检测SARS‑CoV‑2并对其进行分子分型的专用引物，还包括反应组分Master Mix(RNA逆转录酶、聚合酶、扩增buffer、dNTP和EvaGreen荧光染料)、阳性对照和阴性对照。

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测和分子分型方法及试剂盒
本专利技术属于分子生物学检测
，涉及一种病原体的检测方法，特别涉及一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测和分子分型方法及试剂盒。
技术介绍
冠状病毒(Coronaviruses，CoVs)属于冠状病毒科，是自然界广泛存在、能够感染人和动物的一大类病毒家族，在电镜下观察其病毒粒子表面有类似日冕状的纤突而被命名。冠状病毒的基因组较大，其单股正链基因序列长达26～32kb，是已知自然界序列最长的RNA病毒。迄今为止，冠状病毒科病毒仅感染脊椎动物，多引起人和动物呼吸道、消化道症状，其他脏器和神经系统症状也偶有报道。人类冠状病毒感染主要包括上呼吸道、下呼吸道和胃肠道症状，轻微的症状像普通感冒、咳嗽、发热和腹泻等，严重的则会发展成支气管炎和肺炎，并伴随肾脏功能衰竭、急性呼吸窘迫综合征等症状。由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(Severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2，SARS-CoV-2)引起的持续流行性新型冠状病毒肺炎(Cor本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测SARS-CoV-2和分子分型的专用引物，其特征在于，为13套引物组中的一组或多组，13套引物组为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.26所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测SARS-CoV-2和分子分型的专用引物，其特征在于，为13套引物组中的一组或多组，13套引物组为SEQIDNO.1-SEQIDNO.26所示。


2.根据权利要求1所述的专用引物，其特征在于，用于检测SARS-CoV-2的专用引物，为SEQIDNO.1-SEQIDNO.8所示。


3.根据权利要求1所述的专用引物，其特征在于，用于检测SARS-CoV-2的分子分型的专用引物，为SEQIDNO.9-SEQIDNO.26所示。


4.根据权利要求1所述的专用引物，其特征在于，检测SARS-CoV-2的分子分型，是指能准确将SARS-CoV-2区分成S、L、V、G、GH和GR型别。


5.根据权利要求1所述的专用引物的筛选方法，包括以下步骤：
1)检测靶点的选择：选取种间特异、种内保守的基因或区域作为SARS-CoV-2病毒检测的靶基因；选取能准确将SARS-CoV-2分成S、L、V、G、GH和GR型别的相关突变位点区域作为SARS-CoV-2病毒分子分型的检测靶标；同时选择人RNaseP基因作为内对照用于监测样本核酸提取情况；
2)引物设计：首先从GenBank数据库和GISAID数据库中下载SARS-CoV-2经过完整注释作为参考序列的代表株基因序列，将参考序列与NCBI的nr数据库进行核酸序列BLAST，下载比对得到的结果，获取更多检测靶基因序列，使用SnapGene软件在检测靶标两侧设计特异性的扩增引物，使用NCBI在线的引物工具验证引物的特异性，用oligocalc和UMELT在线软件预测扩增产物的熔解温度；
3)引物筛选：针对每个检测位点设计6组引物对，并筛选出能准确区分野生型和突变型的最佳引物对，
4)多重检测引物组的确定：选择能准确区分野生型和突变型的最佳引物对，形成最终4孔13重的HRM分析体系。


6.一种用于检测SARS-CoV-2和分子分型的方法，用于非诊断疾病的目的，包括以下步骤：
(1)使用商品化的病毒RNA提取试剂盒完成测试样本核苷酸的提取；
(2)以待测样本的核苷酸为模板，在上述专用引物组的引导下配制一步法HRM扩增反应体系，进行各检测反应孔特异性扩增；
3)在PCR过程中，由于目标序列的序列特异性，会造成不同PCR产物的碱基含量差异，根据基因序列本身的性质，在饱和染料的作用下，对PCR扩增子进行加热，通过实时监测升温过程中荧光强度的变化，将检测结果进行数据整合及图像绘制，生成PCR产物熔解曲线，我们根据熔解曲线的不同来判断PCR产物中基因序列的差异，从而确定SARS-CoV-2病毒的存在，并对其进行准确地分型。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭俊平，修乐山，孙立莹，
申请(专利权)人：中国医学科学院病原生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11