一种CTSDR与CRISPR/Cas联用检测miRNA的荧光传感器及其制备与应用制造技术

本发明专利技术属于荧光传感器技术领域，具体公开了一种CTSDR与CRISPR/Cas联用检测miRNA的荧光传感器及其制备与应用。所述荧光传感器的制备和检测miRNA过程为：采用DNA单链探针C和B制备双链产物C‑B复合物，将C‑B复合物与单链F、靶序列T(miRNA)混合，孵育，获得含PAM位点的双链DNA，即Cas12a激活剂；再加入预组装的Cas12a‑crRNA复合物和标记有荧光猝灭基团的报告探针，混合，孵育；反应完成后，对蛋白进行灭活；通过对荧光信号的检测即可获知靶物质miRNA的含量。本发明专利技术的荧光传感器将立足点介导的级联链置换反应和CRISPR/Cas12a系统结合实现级联信号放大和对miRNA的高灵敏检测。本传感器制备及检测方法简便、成本低，能有效防止非特异性反应的发生，稳定性和重现性良好。

【技术实现步骤摘要】
一种CTSDR与CRISPR/Cas联用检测miRNA的荧光传感器及其制备与应用
本专利技术涉及荧光传感器
，主要涉及一种用于检测miRNA的荧光传感器，特别是涉及一种CTSDR与CRISPR/Cas联用检测miRNA的荧光传感器及其制备与应用。
技术介绍
MiRNA是一种单链、长约19-23个核苷酸的内源性非编码调控RNA，在生物体的早期发育、细胞分化、增殖、凋亡等过程中发挥着重要的调控作用。大量研究表明，异常表达的miRNA作为新的肿瘤标志物，在肿瘤的诊断、治疗及预后检测等方面发挥重要作用。MiRNA有许多独特的特性，如小尺寸、高序列相似性、易降解，低丰度等，这对其准确的检测和定量提出了分析挑战。传统的miRNA分析方法，包括反转录定量聚合酶链反应(ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction，RT-PCR)、微阵列技术、基因测序、印迹杂交等已得到广泛应用。但它们通常需要复杂的系统和繁琐的样本/试剂处理，这依赖于拥有专门仪器的成熟实验室或训练有素的操作员，存在灵敏度低、方法费时、假阳性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CTSDR与CRISPR/Cas联用检测miRNA的荧光传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(a)制备C-B复合物：采用与crRNA互补的DNA单链探针C、封闭探针B制备双链产物C-B复合物；/n所述探针C的核苷酸序列为：/n5′-TCAACATCAGTCTGATAAGCTACATCGCAAAGGCGA-3′；/n所述探针B的核苷酸序列为：5′-GCGATGTAGCTTATCAGAC-3′；/n(b)构建CTSDR：取步骤(a)所得的C-B复合物，与单链F、靶序列T混合，孵育，获得含PAM的双链DNA，即Cas12a激活剂；/n所述单链F的核苷酸序列选自5′-TGCGATG...

【技术特征摘要】
1.一种CTSDR与CRISPR/Cas联用检测miRNA的荧光传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)制备C-B复合物：采用与crRNA互补的DNA单链探针C、封闭探针B制备双链产物C-B复合物；
所述探针C的核苷酸序列为：
5′-TCAACATCAGTCTGATAAGCTACATCGCAAAGGCGA-3′；
所述探针B的核苷酸序列为：5′-GCGATGTAGCTTATCAGAC-3′；
(b)构建CTSDR：取步骤(a)所得的C-B复合物，与单链F、靶序列T混合，孵育，获得含PAM的双链DNA，即Cas12a激活剂；
所述单链F的核苷酸序列选自5′-TGCGATGTAGCTTATCAGACTGA-3′、5′-TTGCGATGTAGCTTATCAGACTGA-3′、5′-TTTGCGATGTAGCTTATCAGACTGA-3′中的至少一种；所述靶序列T即为miRNA，所述靶序列T的核苷酸序列为：
5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3′；
(c)将预组装的Cas12a-crRNA复合物和标记有荧光猝灭基团的单链报告探针加入步骤(b)所得的反应液中，混合，孵育；
(d)反应完成后，对蛋白进行灭活，得到荧光传感器。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)中，探针C和探针B的摩尔比为1∶1；
和/或，所述步骤(a)中，探针C和B通过变性退火组装制得所述C-B复合物；
和/或，所述步骤(b)中，所述单链F的核苷酸序列为：
5′-TTGCGATGTAGCTTATCAGACTGA-3′；
和/或，所述步骤(b)中，C-B复合物和单链F的摩尔比为1∶1；
和/或，所述步骤(b)中，C-B复合物与单链F、靶序列T混合形成的混合液中，C-B复合物的浓度为1-15nM，靶序列T的终浓度≥66.4fM；
和/或，所述步骤(b)中，孵育温度为35-40℃；
和/或，所述步骤(b)中，孵育时间为20-80min；
和/或，所述步骤(c)中，Cas12a-crRNA复合物的预组装方法为：将Cas12a与crRNA等比例混合，在室温下放置10-20min；
和/或，所述步骤(c)中，所述单链crRNA的核苷酸序列为：
5′-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGAUGUAGCUUAUCAGACUG-3′；
和/或，所述步骤(c)中，所述单链报告探针的核苷酸序列为：5′-FAM-TTATT-BHQ1-3′；
和/或，所述步骤(c)中，孵育在避光条件下进行；
和/或，所述步骤(c)中，孵育温度为35-40℃；
和/或，所述步骤(c)中，孵育时间为40-80min；
和/或，所述步骤(d)中，蛋白灭活温度为60-80℃；
和/或，所述步骤(d)中，蛋白灭活时间为5...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜玉蓉，丁世家，张德才，李星蓉，郑清源，甘秀峰，刘萍，舒晓佳，蔡晓颖，白惠洁，凡宁可，程文倩，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50