一种龙眼开花调控基因DlWRKY25及其调控蛋白与应用制造技术

一种龙眼开花调控基因DlWRKY25，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术龙眼DlWRKY25基因的开放阅读框（open reading frame,ORF）全长为1038 bp，编码345个氨基酸，具有典型的WRKY结构域和锌指结构，属于Ⅲ型WRKY蛋白。转基因拟南芥结果表明，作为典型的转录因子，龙眼

【技术实现步骤摘要】
一种龙眼开花调控基因DlWRKY25及其调控蛋白与应用
本专利技术涉及分子生物
，具体涉及一种龙眼开花调控基因及其应用。
技术介绍
龙眼(DimocarpuslonganaLour.)是我国热区重要的经济果树之一，在我国具有2000多年的栽培历史。龙眼的栽培品种花芽分化具有季节性，并且需要低温诱导，在我国主产区，如广东的粤西地区和海南等，由于不具备龙眼成花所需的低温，常常需要用KClO3来催花，但这种方法存在较大的局限性，如受品种、环境等因素的制约。对龙眼成花机理的研究是解决这一问题的根本途径，查阅相关文献，龙眼成花的研究大多处在生理生化水平，其分子机理研究报道较少。作为高等植物中一类重要的转录调控因子，该基因家族因含有高度保守的WRKY结构域而得名，其结构域分别是N-端核心序列WRKYGQK与C-端的锌指结构。根据其结构域的数目及锌指结构序列的特点，WRKY蛋白通常被划分为3个主要类型。目前研究表明，WRKY基因家族大部分成员参与植物的生长发育以及不同的逆境胁迫响应过程。因其能特异结合位于下游基因启动子区的顺式作用元件，从而对植物的生长发育、胁迫应答和激素信号转导产生影响。WRKY基因的研究主要集中在其对各种逆境胁迫的响应，与成花相关的研究较少。成花时间的遗传调控和成花相关基因的鉴定和阐明，对缩短童期及提高果树产量等都有重要意义。尽管目前已有研究表明WRKY在植物开花中起一定作用，比如，FvWRKY71能够促进开花和增加分枝。在长光照下，过表达WRKY25导致拟南芥提前开花。MdWRKY35可能通过响应不同的逆境胁迫进而参与不同的成花过程。但WRKY具体如何影响成花过程，目前尚不完全清楚。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种龙眼开花调控基因及其表达的蛋白与应用。本专利技术目的按如下技术方案实现：一种龙眼开花调控基因DlWRKY25，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。一种龙眼开花调控蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术还提供了含有前述编码基因的载体。本专利技术还提供了含有前述载体的工程菌。本专利技术进一步提供了前述基因在促进植株开花方面的应用。进一步地，所述应用为将所述工程菌侵染植株，获得促进开花的转基因植株。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术对DlWRKY25基因进行克隆、亚细胞定位分析、转基因功能分析，同时通过qRT-PCR对DlWRKY25基因在不同器官、花器官发育过程的表达规律进行研究，解析了DlWRKY25基因的功能；明确其在龙眼成花过程中的作用，为利用分子辅助加快早晚熟龙眼新品种的培育奠定基础。本专利技术龙眼DlWRKY25基因的开放阅读框(openreadingframe，ORF)全长为1038bp，编码345个氨基酸，具有典型的WRKY结构域和锌指结构，属于III型WRKY蛋白。qRT-PCR结果表明，该基因具有组织表达特异性，在茎中相对表达量较高、果皮和幼果器官中次之。烟草表皮细胞瞬时表达结果显示，荧光信号主要集中在细胞核，DlWRKY25编码的蛋白定位于细胞核。转基因拟南芥结果表明，作为典型的转录因子，龙眼DlWRKY25正调控植物成花；过表达DlWRKY25基因的拟南芥植株相对于野生型都能表现出不同程度的早花表型，野生型植株26天左右开花，而转基因株系在16-18天开花。DlWRKY25在‘四季蜜’龙眼成花诱导早期呈下调表达，T1时期仅为T2时期的5倍，而在′石硖′龙眼成花诱导过程中DlWRKY52的表达水平未出现显著性差异表达。本专利技术为深入探究龙眼DlWRKY25基因在其生长发育过程中的分子生物学功能研究奠定了良好的基础。附图说明图1为龙眼DlWRKY25基因PCR扩增图。图2为不同物种(阿月浑子，Pistaciavera，XP_031278909.1；橡胶，Heveabrasiliensis，XP_021670644.1)间WRKY蛋白序列比对图。左侧框部分表示WRKYGQK氨基酸序列，右侧框部分表示C2H2锌指结构基序。图3为龙眼DlWRKY25与GenBank中相似序列的进化树分析图。图4为DlWRKY25在龙眼不同组织中的相对表达量示意图。不同字母靶标表示差异达到显著水平。图5为DlWRKY25在2种龙眼品种成花诱导过程中的表达模式图。不同字母靶标表示差异达到显著水平。T1代表休眠期，T2代表花分生组织出现时期(“红点”)，T3代表花器官形成时期。图6为DlWRKY25蛋白在烟草中的亚细胞定位图。GFP：绿色荧光蛋白；Chloroplast：叶绿体自发荧光；Bright：明场；Merged：2种荧光与明场融合；标尺为10μm。图7为DlWRKY25转基因拟南芥成花表型图。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1目的基因的克隆1材料和方法1.1植物材料来源中国热带农业科学院南亚热带作物研究所龙眼种质圃中3组长势和树龄(9年龄)一致的具有不断成花习性的′四季蜜′龙眼和正常成花主栽品种′石硖′龙眼。1.2取样目的与部位成花诱导表达分析取样部位：三个成花诱导时期的顶芽，分别为T1休眠期(顶芽未萌动，水分含量很少，硬度高)；T2″红点″时期(顶芽开始萌动发育成花序，芽轴伸长，基部的腋芽明显膨大，变为红色，俗称″红点″)；T3第1花序时期，(顶芽完全发育成花序，未开花)。组织表达分析取样部位：取′四季蜜′龙眼的花、花芽、叶、果皮、果肉、根、种子、茎和幼果(花后60d整果)等器官。所有的试验设3次重复，取样后立即放入液氮速冻并转入-80℃冰箱中保存、备用。1.3DlWRKY25基因序列的克隆及生物信息分析从龙眼基因组数据库(NCBISequenceReadArchive，SRA315202)中获得DlWRKY25基因(Dlo_011410.1)的碱基序列和氨基酸序列信息。利用PrimerPremier5.0根据DlWRKY25基因的ORF序列设计引物W25-S和W25-A(表1)，委托天一辉远生物科技有限公司(广州)合成。用北京华越洋生物公司的植物RNA提取试剂盒提取‘四季蜜’龙眼叶片的RNA，采用Takara公司的PrimeScriptRT-PCR试剂盒，具体操作步骤参照说明书，反转录cDNA作为模板，进行PCR扩增克隆DlWRKY25基因。扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环(变性-延伸)；72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物进行切胶回收和纯化连接到pMD18-T载体上，转化DH5α感受态细胞，PCR筛选阳性克隆，挑取阳性单克隆送天一辉远生物科技有限公司(广州)进行测序。利用在线软件SMART程序(http：//smart.emblheidelberg.de/)预测蛋白结构域，利用ExPASy(http：//e本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种龙眼开花调控基因

【技术特征摘要】
1.一种龙眼开花调控基因DlWRKY25，其核苷酸cDNA序列如SEQIDNo.1所示。


2.如权利要求1所述龙眼开花调控基因表达的调控蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。


3.含如权利要求1所述龙眼开花调控基因的载体。...

【专利技术属性】
技术研发人员：决登伟，桑雪莲，石胜友，唐建民，
申请(专利权)人：重庆文理学院，
类型：发明
国别省市：重庆;50