一种控制大豆-根瘤菌匹配性的R基因及其蛋白质和应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及新基因的应用，特别是指一种控制大豆‑根瘤菌匹配性的R基因及其蛋白质和应用。本发明专利技术公开的基因

【技术实现步骤摘要】
一种控制大豆-根瘤菌匹配性的R基因及其蛋白质和应用
本专利技术属于生物
，涉及新基因的应用，特别是指一种控制大豆-根瘤菌匹配性的R基因及其蛋白质和应用。
技术介绍
栽培大豆[Glycinemax(L.)Merr]起源于我国，是世界上重要的粮食、饲料、油料和能源作物，传统“五谷”之一，是人们日常饮食中重要的组成部分(Palanderetal.,2005)。同时，随着我国经济的发展和人口激增对粮食需求的压力，我国在粮食生产中大量施用化肥，其中以氮肥最甚。根据世界粮农组织FAO的统计，我国2002年到2014年间每年的氮肥使用量不断上升；我国耕地面积虽仅占全世界的8％，但氮肥使用量却达到了全世界使用总量的35％(http://faostat.fao.org/)。氮肥的过度施用和养分流失，导致了严重的水体富营养化污染；同时也影响了土壤有机质组成，降低了生物活性，导致土壤板结。固氮微生物能够利用其自身合成的固氮酶将大气中的氮气还原成可被植物直接利用的氨，即生物固氮。大豆和根瘤菌共生固氮既减少能源消耗(工业氮肥生产耗能多)，又能很好地在改良土壤，是提高豆科作物氮效率的重要途径。在全球生态系统中，豆科植物通过共生固氮方式的固氮量占生物固氮量的60％-70％。在农业系统中，大豆占据豆类共生固氮86％的绝对性优势，每年产氮量达1644万吨(Herridge2008)；所以利用大豆和根瘤菌建立的共生固氮体系，对农业生产及绿色可持续农业的发展具有重要意义。大豆与根瘤菌之间存在匹配性。同一株根瘤菌在不同的大豆品系上，或不同的根瘤菌在同一个大豆品系上的结瘤和固氮特性存在较大差别。选择匹配性好，共生固氮能力强的豆科植物-根瘤菌组合，才能更好发挥共生固氮的优良效应。能筛选到具有广谱匹配性能的根瘤菌，则更易于推广使用。例如慢生型大豆根瘤菌USDA110虽是国际公认的高效广谱的根瘤菌，能够在一些大豆品系上较好地结瘤固氮，但在一些大豆品系上仍然只具有较低的共生固氮能力。我国根瘤菌分布具有明显的地理分布特征。在我国的不同地区分布着不同种类的根瘤菌。田长富等发现在我国东北地区和华南地区，慢生型根瘤菌占比到达100％和99.6％；而在碱性土壤的黄淮海地区，慢生型根瘤菌占比30％，快生型根瘤菌70％；而在新疆半干旱的碱性土壤地区，慢生型根瘤菌和快生型根瘤菌各占约50％(Tianetal.,2012)。已有研究表明，人为接种根瘤菌可显著提高豆科作物的共生固氮能力，促进根系的生长并提高作物产量(Ferreiraetal.,2009)。在美国和巴西等大豆主产国，接种大豆匹配性根瘤菌做为大豆“减肥”增产的重要措施之一，被大面积推广和应用(Mendesetal.,2003；Sogut2006；deFreitasetal.,2012)。我国接种根瘤菌的面积相对较小，但是也取得了良好的效益(汤复跃等2011)。黑龙江海龙市率先在大豆种植区接种根瘤菌达80％，亩增产10％以上。但近十几年来，我国大豆接种根瘤菌接种总面积没有提高，反而减少，根瘤菌接种面积不到大豆种植面积的3％，与国际上相差甚远。这其中一个重要原因在于根瘤菌菌剂在田间的竞争结瘤能力弱于土著根瘤菌。大豆起源于我国，大豆主产区的土壤中一般都存在着大量的适应性和结瘤能力强，但固氮能力低下的土著性根瘤菌(伍恵，2004；孙传瑞，2004)，影响了人工根瘤菌菌剂的结瘤和效力发挥。因此，限制土壤中土著根瘤菌与大豆的结瘤，对于接种的高效根瘤菌的效力发挥具有重要意义。然而，关于如何让大豆限制土著根瘤菌，而优先与人为施加的高效根瘤菌菌剂结瘤的研究和技术专利技术尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术提出一种控制大豆-根瘤菌匹配性的R基因及其蛋白质和应用，解决了大豆与根瘤菌匹配性的调控、以及如何利用大豆与根瘤菌的匹配性来提高大豆固氮能力，进而提高大豆对氮元素的利用率的技术问题。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种控制大豆-根瘤菌匹配性的R基因，所述基因序列如SEQIDNO.2或如SEQIDNO.2经过修饰后的核苷酸序列所示。进一步，所述修饰包括转座子的插入、碱基的缺失或增加或CRISPR-Cas9修饰。所述R基因的序列还可以如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7或SEQIDNO.8所示。用于鉴定上述R基因的功能标记引物对GmSINE1-F/R，所述GmSINE1-F序列如SEQIDNO.9所示，GmSINE1-R序列如SEQIDNO.10所示。所述功能标记引物对GmSINE1-F/R在用于扩增序列如SEQIDNO.2的R基因时扩增的条带为443bp，在用于扩增序列如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7或SEQIDNO.8所示的R基因时扩增条带为622bp。上述的R基因编码的蛋白质。进一步，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。该基因的启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。上述的R基因或其编码的蛋白质在改良大豆及大豆-根瘤菌组合，减弱和限制土著根瘤菌在大豆上的结瘤，增强大豆与根瘤菌菌剂匹配性、增强共生固氮能力中的应用。上述的R基因和其启动子在改良豆科作物共生固氮中的应用。进一步，其步骤为：构建包含有序列如SEQIDNO.2所示的R基因和序列如SEQIDNO.1所示的启动子的过表达载体或R基因的RNAi载体，通过农杆菌介导转化，然后筛选转基因阳性植株进行培养，接种根瘤菌菌剂，继续培养，完成增强大豆共生固氮能力的应用。本专利技术具有以下有益效果：1、本申请的大豆R基因GmNNL1通过栽培大豆共生固氮表型的全基因组关联分析方法获得，利用遗传群体验证、大豆毛根瞬时转化体系、稳定转基因植株以及HR反应鉴定实验等成功地进行了分离、克隆和验证。大豆的R基因GmNNL1是一个可以调控特定根瘤菌在大豆上结瘤数量的有效基因，它可以通过直接识别慢生型根瘤菌特定效应蛋白NopP的单倍型来调控结瘤数量，可限制土著根瘤菌的共生结瘤，使得大豆优先与人为施加的高效根瘤菌剂结瘤，并且能够提高共生固氮能力。对R基因精细调控大豆-根瘤菌匹配性进而提高作物地上部分生物量的分子机制并不清楚，该基因揭示了其参与抑制根毛侵染调控结瘤进而影响地上部分生物量的分子机制。2、本申请的具有功能型R基因的GmNNL1HT1单倍型的大豆能够限制了土壤中分布广泛的带有NopPUSDA110/USDA6单倍型的慢生型根瘤菌在其上的结瘤，但是不能限制其他根瘤菌在其上的结瘤；具有非功能型R基因的GmNNL1HT2-HT6单倍型(编码的TIR-NBS-LRR蛋白结构不完整)不能够限制根瘤菌在其上的结瘤。通过GmNNL1基因启动子(SEQID.NO：1所示序列)驱动GmNNL1基因在大豆植株中超量表达可达减少特定根瘤菌的结瘤数量，从而使其与接种的高效大豆根瘤菌菌剂更好地结瘤，提高大豆的共生固氮能力；另外也可将有功能的GmNNL1基因进行RNAi或者敲除，使转基因大豆能与土著根瘤菌结瘤，提高共生固氮能力(尽管效率低)。3、GmNNL1-NopP识别关系的打破可增本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种控制大豆-根瘤菌匹配性的

【技术特征摘要】
1.一种控制大豆-根瘤菌匹配性的R基因，其特征在于：所述基因序列如SEQIDNO.2或如SEQIDNO.2经过修饰后的核苷酸序列所示。


2.根据权利要求1所述的控制大豆-根瘤菌匹配性的R基因，其特征在于：所述修饰包括转座子的插入、碱基的缺失或增加或CRISPR-Cas9修饰。


3.根据权利要求2所述的控制大豆-根瘤菌匹配性的R基因，其特征在于：所述基因序列如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7或SEQIDNO.8所示。


4.用于鉴定权利要求1-3任一项所述的R基因的功能标记引物对GmSINE1-F/R，其特征在于：所述GmSINE1-F序列如SEQIDNO.9所示，GmSINE1-R序列如SEQIDNO.10所示。


5.权利要求1-3任一项所述的R基因编码的蛋白质。...

【专利技术属性】
技术研发人员：王学路，张豹，李友国，
申请(专利权)人：河南大学，华中农业大学，
类型：发明
国别省市：河南;41